دانشگاه آزاد اسلامی
واحد علوم و تحقیقات
پایان نامه کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی-میکروبیولوژی (M.Sc)
عنوان
بررسی مقایسهای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم بوویس به روش SDS-PAGE
استاد راهنما
دکتر احمد رضا بهرمند
مشاور
دکتر مهناز سیفی
سال تحصیلی 1392
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب
|
|
چکیده | 1 |
فصل اول- مقدمه | 3 |
1-1. کلیات سل | 4 |
1-2. بیان مسئله | 5 |
1-3. اهمیت و ضرورت | 7 |
1-4. اهداف | 8 |
فصل دوم- پیشینه تحقیق | 9 |
2-1. تاریخچه | 10 |
2-2. مایکوباکتریومها | 11 |
2-3. طبقه بندی مایکو باکتریومها | 12 |
2-3-1. فتو کروموژن | 13 |
2-3-2. اسکوتوکروموژن | 13 |
2-3-3. غیر کروموژن | 14 |
2-3-4. سریع الرشد | 14 |
2-4. باکتریولوژی سل | 14 |
2-5. مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی | 15 |
2-6. خصوصیات رشد | 16 |
2-7 . فیزیولوژی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس | 17 |
2-7-1. انتقال مواد غذایی توسط غشاء خارجی | 18 |
2-7-2. انتقال توسط غشاء داخلی | 18 |
2-7-2-1. انتقال ترکیبات حاوی کربن | 18 |
2-7-2-2. انتقال ترکیبات غیر کربن | 19 |
2-8. فاکتورهای ویرولانس | 20 |
1-9. دیواره سلولی | 21 |
2-10. بیوشیمی دیواره سلولی | 23 |
2-11. بیماریزایی | 23 |
2-11-1. مکانیسم بیماریزایی | 25 |
2-12. درمان سل | 26 |
2-12-1. درمان سل حساس به دارو | 26 |
2-12-2. درمان سل مقاوم به دارو | 26 |
2-13. مقاومت دارویی مایكوباكتریوم توبركلوزیس | 27 |
2-14. مکانیسم مولکولی مقاومت دارویی | 28 |
2-14-1. مقاومت به ریفامپین | 28 |
2-14-2. مقاومت به ایزونیازید | 29 |
2-14-3. مقاومت به پیرازین آمید | 29 |
2-14-4. مقاومت به اتامبوتول | 30 |
2-14-5. مقاومت به استرپتومایسین | 30 |
2-14-6. فلورو کینولونها | 30 |
2-14-7. آمینوگلیکوزیدها | 31 |
2-14-8. سیکلوسرین | 31 |
2-14-9. پاراآمینوسالیسیلیک | 32 |
2-15. انواع سل | 33 |
2-15-1. سل ریوی | 33 |
2-15-2. سل خارج ریوی | 33 |
2-15-2-1. سل عقدههای لنفاوی | 33 |
2-15-2-2. سل پلور | 34 |
2-15-2-3. سل استخوانی | 34 |
2-15-2-4. سل سیستم عصبی مرکزی | 34 |
2-15-2-5. سل شکمی | 34 |
2-15-2-6. سل دستگاه تناسلی | 35 |
2-15-2-7. سل پریکاردیت | 35 |
2-15-2-8. سل ارزنی | 35 |
2-16. سل در کودکان | 36 |
2-17. سل و ایدز | 36 |
2-18. روشهای تشخیص سل | 37 |
2-18-1. تست پوستی | 37 |
2-18-2. کشت | 37 |
2-18-3. تهیه اسمیر | 38 |
2-18-4. تکنیک PCR | 38 |
2-18-5. بررسی اینترفرون گاما | 38 |
2-18-6. رادیوگرافی ریه | 39 |
2-19. اپیدمیولوژی | 39 |
2-19-1. وضعیت بیماری سل انسانی در ایران | 41 |
2-20. مایکوباکتریوم بوویس | 44 |
2-20-1. اهمیت سل گاوی | 45 |
2-21. مایکوباکتریوم بوویس ب.ث.ژ | 45 |
2-21-1. فیلوژنی | 45 |
2-21-2. تاریخچه BCG | 48 |
2-21-3. تاریخچه تولید و مصرف واکسن ب.ث.ژ در ایران | 50 |
2-21-4. ایمنیزایی | 51 |
2-21-5. لزوم طراحی واکسن جدید | 52 |
2-22. پروتئومیکس مایکوباکتریومها | 53 |
2-23. پیشینه تحقیق پروتئومیکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و بوویس | 58 |
فصل سوم- مواد و روشها | 61 |
3-1. نمونه گیری | 63 |
3-2. کشت و جداسازی باکتری | 64 |
3-2-1. مواد مورد نیاز برای تولید محیط لوون اشتاین جانسون به میزان 5/1 لیتر | 64 |
3-2-2. طرز تهیه محیط کشت | 64 |
3-2-3. آلودگیزدایی و تغلیظ نمونهها | 65 |
3-2-3-1. آماده سازی محلولها | 66 |
3-2-4. روش کار کشت | 66 |
3-2-4-1. محیط کشت حاوی تیوفن 2- کربوکسیلیک اسید هیدرازید | 67 |
3-3. تشخیص میکروسکوپی مایکوباکتریومها | 67 |
3-3-1. تهیه گستره | 67 |
3-3-2. رنگآمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O | 68 |
3-3-3. رنگآمیزی ذیل- نلسون | 69 |
3-3-4. رنگآمیزی کینون (رنگآمیزی سرد) | 70 |
3-3-5. بررسی و آزمایش گسترش | 71 |
3-4. بررسی لولههای کشت | 71 |
3-5. شناسایی و تعیین هویت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و بوویس | 72 |
3-5-1. تست نیاسین | 77 |
2-5-1-1. معرفها و مواد لازم تست نیاسین | 72 |
3-5-1-2. آماده سازی محلولها ی نیاسین | 72 |
3-5-1-3. مراحل کارتست نیاسین | 73 |
3-5-2. آزمونهای احیای نیترات | 73 |
3-5-2-1. معرفها و مواد لازم تست نیترات | 73 |
3-5-2-2. آماده سازی معرفهای تست نیترات | 74 |
3-5-2-3. مراحل انجام کار تست نیترات | 74 |
3-5-2-4. استانداردهای احیاء نیترات | 74 |
3-5-3. تست کاتالاز | 75 |
3-5-3-1. محیط و مواد مورد نیاز | 76 |
3-5-3-2. آماده سازی محلولهای تست کاتالاز | 76 |
3-5-3-3. مراحل انجام آزمایش روش نیمه کمی کاتالاز و کاتالاز 68 درجه | 76 |
3-5-3-4. نتایج و تفسیر آزمایش کاتالاز | 77 |
3-5-4. حساسیت به تیوفن 2- کربوکسیلیک هیدرازید (TCH) | 77 |
3-6. آزمایشات حساسیت داروئی در مایکوباکتریومها | 77 |
3-6-1. تهیه محلول استاندارد مک فارلند | 78 |
3-6-2. تهیه سوسپانسیون باکتری | 78 |
3-7. کشت سویههای انتخابی در محیط میدل بروک 7H9 | 78 |
3-7-1. مواد مورد نیاز | 78 |
3-7-1-1. آماده سازی محیط | 78 |
3-7-1-2. انتحاب سویهها و کشت | 80 |
3-8. جمعآوری سویهها میکروبی، استخراج و خالصسازی پروتئین | 80 |
3-8-1. استخراج پروتئینهای غشایی | 80 |
3-8-1-1. مواد مورد نیاز | 80 |
3-8-1-2. تهیه بافر و محلولها | 80 |
3-8-1-3. روش کار | 81 |
3-8-1-4. استخراج پروتئینهای ترشحی | 81 |
3-8-2. خالصسازی پروتئین | 81 |
3-8-2-1. مواد مورد نیاز | 81 |
3-8-2-1-1. آماده سازی محلولها و مواد | 81 |
3-8-2-1-2. روش کار ترسب پروتئینهای غشایی | 83 |
3-8-2-1-3. ترسیب پروتئینهای ترشحی | 83 |
3-8-2-2. تعیین غلظت پروتئینها | 84 |
3-8-2-2-1. مواد مورد نیاز | 84 |
3-8-2-2-2. آماده سازی محلول برادفورد | 85 |
3-8-2-2-3. روش کار | 85 |
3-9. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید(تک بعدی) | 85 |
3-9-1. مواد مورد نیاز | 86 |
3-9-2. آماده سازی مواد | 86 |
3-9-3. روش کار | 88 |
3-9-3-1. رنگآمیزی کوماسی بلو R-250 | 90 |
3-9-3-2. رنگآمیزی Blue Silver Staining | 90 |
3-10. تصویر برداری و آنالیز ژلها | 90 |
فصل چهارم- نتایج | 91 |
4-1. جمعیت مورد مطالعه | 92 |
4-2. درصد سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جمعآوری شده از بیماران با توجه به موضع جداسازی | 93 |
4-3. مشاهده لام رنگآمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O | 93 |
4-4. مشاهده لام رنگآمیزی ذیل-نلسون | 94 |
4-5. نتایج کشتها | 94 |
4-6. آزمونهای بیوشیمیایی وحساسیت آنتیبیوتیکی | 95 |
4-7. نتایج تعیین غلظت پروتئینها | 97 |
4-8. نتایج مربوط به تفکیک پروتئینها بر اساس وزن مولکولی | 98 |
فصل پنجم- بحث و نتیجه گیری | 102 |
پیشنهاد | 108 |
منابع | 109 |
چکیده انگلیسی | 117 |
فهرست نمودارها
|
|
2-1: میزان بروز بیماری سل در طول 46 سال گذشته در ایران | 41 |
4-1: نتایج کشت مثبت | 92 |
4-2: منحنی استاندارد | 98 |
فهرست جداول
|
|
2-1: تاکسونومی اعضای کمپلکس توبرکلوزیس | 15 |
2-2: داروهای خط دوم درمان توبركلوزیس | 32 |
2-3: تخمین موارد ومتوسط میزان بروز سل در جهان در سال2010 | 40 |
2-4: به تفکیک دانشگاههای علوم پزشکی کشور | 42 |
2-5: برخی تغییرات ژنی در سویههای BCG M. bovis | 47 |
3-1: نحوه گزارش میکروسکوپی | 71 |
3-2: مواد تشکیلدهنده بافرتخلیص | 81 |
3-3: مواد تشکیلدهنده محلول PBS x10 | 83 |
3-4: مواد تشکیلدهنده محلول برادفورد | 85 |
3-5: مواد تشکیلدهنده Running Buffer 10% | 86 |
3-6: مواد تشکیلدهنده Coomassie Gel stain | 87 |
3-7: مواد تشکیلدهنده Coomassie Gel Destain | 87 |
3-8: مواد تشکیلدهنده Fixation solution | 87 |
3-9: مواد تشکیلدهنده Stainining solution | 88 |
3-10: مواد تشکیلدهنده ژل 10%,12.5% Separating | 89 |
3-11: مواد تشکیلدهنده ژل Stacking 5% | 89 |
4-1: درصد نمونههای بالینی | 93 |
4-2: نتایج تستهای بیوشیمیایی | 96 |
4-3: نتایج تستهای حساسیت آنتیبیوتیکی و TCH | 97 |
فهرست تصاویر | |
2-1: استخوان سـتون فقرات بدشـکل در مومیایی، به دلیل بیماری سـل | 11 |
2-2: عکسبرداری توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس | 16 |
2-3: کلنیهای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون | 17 |
2-4: نمای شماتیک ازساختمان دیواره مایکوباکتریوم توبرکلوزیس | 22 |
2-5: میزان بروز مایکوباکتریوم توبرکلوزیس درنقاط مختلف جهان در سال 2012 | 40 |
2-6: درخت تبارشناسی زیرسویههای مختلف BCG M. bovis بر اساس اطلاعات پراکندگی آنها و خصوصیات مولکولی | 46 |
2-7: برخی از عکسهای تاریخی مربوط به کاشفان واکسن ب ث ژ | 49 |
3-1: مرحله دیالیز | 84 |
3-2: آماده سازی صفحات شیشه ای | 88 |
4-1: باسیل اسید فست در رنگ امیزی اورامین | 93 |
4-2: باسیل اسید فست در رنگ امیزی ذیل-نلسون | 94 |
4-3: فاکتور طنابی (cord factor) | 95 |
4-4: تفسیر تست نیترات | 95 |
4-5: باندهای پروتئینهای غشایی سویههای M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل 10% و رنگ آمیزی آمیزی کوماسی بلو R-250 | 99 |
4-6: باندهای پروتئینهای غشایی سویههای M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل 10% رنگ آمیزی Blue Silver Staining | 100 |
4-7: باندهای پروتئینهای ترشحی سویههای M. bovis و M. TB | 101 |
5-1: تصویر A سویهM. tuberculosis H37Rv و تصویرB سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس | 106 |
چکیده
مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل بیماری سل میباشد. از زمانی که سازمان جهانی بهداشت در سال 1993، توبرکلوزیس را به عنوان یک فوریت اعلام نمود، تا کنون کنترل آن به دلیل وجود سوشهای مقاوم به درمان و تداخل با بیماری ایدز دچار مشکل شده است. مایکوباکتریوم بوویس به عنوان عامل سل گاوی به صورت موردی انسان را نیز درگیر می کند و به عنوان یکی از معضلات بهداشتی با گستره جهانی محسوب می شود. مبارزه با این آلودگی امروزه باعث گسترش بررسی آنتیژنهای باکتری به منظور دسترسی بیومارکرهای موثر در تشخیص، اهداف دارویی و اجزای واکسن مورد اهمیت واقع شدهاند.
جهت مقایسه پروفایل پروتئینی سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس به درمان و مایکوباکتریوم بوویس از کل نمونههای ارسالی 6 ماهه اول سال 1392 به بخش مایکوباکتریولوژی انسیتو پاستور، 100 نمونه مورد ارزیابی قرار گرفت. در ابتدا نمونههای کلینیکی با روش ان استیل- ال سیستئین- هیدروکسید سدیم و در محیط کشت لونشتاین جانسون کشت داده شد و جهت افتراق مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و مایکوباکتریوم بوویس از سایر مایکوباکتریومها، از تستهای بیوشیمیایی (نیترات، کاتالاز، نیاسین و TCH) و حساسیت آنتی بیوتیکی استفاده شد. کلونیها در محیط میدل بروک 7H9 کشت داده شد، پس از برداشت کلونیهای جدید، به منظور استخراج پروتئینهای ترشحی و غشایی از روش های سونیکاسیون، رسوب دهی با سولفات آمونیوم و الکل استفاده گردید و به وسیله روش برادفورد تعیین غلظت شد و در نهایت مقایسه با روش الکتروفورز تک بعدی انجام پذیرفت.
با بررسی باندهای حاصله از پروتئینهای غشایی و ترشحی در 5 سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس هیچگونه تفاوتی مشاهده نشد و همچنین در 5 سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم بوویس نیز تفاوتی مشاهده نشد. در سویههای مایکوباکتریوم بوویس، برای پروتئینهای غشایی باندهایی در محدوده 15 تا 85 کیلودالتون مشاهده شد و در سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس نیز باندهای از 15 تا 120 کیلودالتون مشاهده شد این دو سویه در محدودههای وزنی تقریبا 30 تا 116 کیلو دالتون بسیار متفاوت بوده اند.
در بررسی پروتئینهای ترشحی در سویههای مایکوباکتریوم بوویس، باندهایی در محدوده 15 تا 115 کیلودالتون و در سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس باندهایی از 18 تا 114 کیلودالتون مشاهده شدند که اختلافات وزنی کمی در این محدودهها مشاهده شد.
نتایج حاصل از تفکیک باندهای پروتئینی سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس، حاکی از شباهت نسبی با سویه استانداردM. tuberculosis H37Rv نسبت به مطالعات دیگر است. اختلافات مشاهده شده در باندهای حاصله از هر دو نوع پروتئینهای سویههای مایکوباکتریوم بوویس و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس می تواند مرجعی برای بررسیهای بیشتر پروتئومیکس در باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و بوویس باشد.
به نظر میرسد اختلاف بیان باندهای پروتئینی سویههای حساس و بوویس با به کارگیری روش های مناسب می تواند به عنوان پروتئین مارکر و یا حتی بیومارکر موثر در تشخیص سویههای حساس و بوویس از یکدیگر، اهداف دارویی و اجزای واکسن قابل استفاده باشد.
فصل اول
مقدمه
1-1. کلیات سل
سل بیماری است که از دیرباز در بین جوامع مختلف شیوع داشته است و عامل آن را از اسکلت انسانهای عصر حجر و استخوانهای مومیایی شده مصریان باستان جدا کرده اند .(Zink A R. et al., 2003) امروزه یكی از بزرگترین مسائل بهداشتی جهان، بیماری سل است. حدس زده میشود كه از هر سه نفر جمعیت جهان، یک نفر به باسیل سل آلوده بوده و درهر ثانیه یک نفر به تعداد آنان افزوده می شود. نگران كننده این است كه طبق برآوردهای موجود 50 میلیون نفر از این افراد، به باسیل سل مقاوم به چند دارو (MDR-TB) آلوده هستند. درحال حاضر 12 میلیون نفر درجهان به بیماری سل مبتلا هستند كه بیش از 80% این موارد، تنها مربوط به 22 كشور درحال توسعه جهان است.
در سال 2010 میلادی، حدود 8/8 میلیون نفر جدید به سل فعال مبتلا شده و حدود 1/1 میلیون نفر در اثر این بیماری جان میسپارند. بیش از 90% موارد بیماری و مرگ ناشی از سل در كشورهای در حال توسعه رخ میدهد، كشورهایی كه 75% موارد بیماری در آنها به فعالترین گروه سنی به لحاظ اقتصادی (یعنی 15 تا 54 سالگی) تعلق دارد.
آلودگی همزمان به ویروس ایدز خطر ابتلا به بیماری سل را به طور معنا داری افزایش میدهد. كشورهای با شیوع بالای HIV، به ویژه كشورهای واقع در افریقای زیر صحرا، شاهد افزایش چشمگیر تعداد بیماران مبتلا به سل و افزایش 2 تا 3 برابر میزانهای بروز گزارش شده سل در دهه 90 بوده اند. در سال 2010، میزان شیوع عفونت اچ آی وی در میان بیماران مبتلا به سل در جهان 13% تخمین زده شده است (W.H.O., 2010).
سل یک بیماری تنفسی است که راه عمده سرایت آن ذرات تنفسی[1] وخلط سینه بیماران[2] میباشد. اما روشهای سرایت دیگری همچون تلقیح مستقیم باسیل سل در پوست مجروح کسانی که با بافت آلوده سروکار دارند نیز توصیف شده است. ورود باسیل سل به بدن یک فرد ضرورتا ایجاد بیماری سل نمی کند، اولین فاکتورهای افزایش دهنده امکان ابتلاء فرد آلوده شده، خصوصیات شخصی هر فرد (مانند سن، جنس، ساختمان بدن و حساسیت ژنتیکی)، عوامل اجتماعی (مانند فقر غذایی و شرایط زیستی) و عواملی نظیر سرکوب سیستم ایمنی[3] ناشی از داروهای استروئیدی یا بیماریهایی نظیر سرطان خون، بیماریهای دستگاه رتیکولواندوتلیال، دیابت شیرین[4]، بیماریهای قارچی سیستمیک و ایدز[5] میباشد (Jonas V. et al., 1993).
کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (MTB) [6]که شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس[7]، افریکانوم[8]، بوویس[9]، بوویس[10]BCG، کاپرهای[11]، میکروتی(mycobacterium microti)، پنیپدی، dassie bacillusو کانتی (mycobacteriu canettii)، گرچه خصوصیات فنوتیپی متفاوتی در تستهای بیوشیمیایی از خود نشان می دهند اما همولوژی بالایی به لحاظ ژنتیکی دارند .(Somoskovi A. et al., 2007)افتراق اعضای کمپلکس توبرکلوزیس برای پیشبرد درمان موفق ضروری است بالاخص در مناطقی که بیماری به صورت اپیدمیک در می آید یا تماس انسان و حیوان زیاد است .(Barouni A.S. et al., 2004)
همانطور که ذکر شد M. bovis یکی از قدیمیترین و مهمترین عامل بیماری سل بین انسان و دام (Zoonoses) و به عنوان یکی از معضلات بهداشتی با گستره جهانی محسوب می شود. میزان مرگ و میر ناشی از M. bovis بیشتر از M. tuberculosis میباشد .(Majoor C.J. et al., 2011) تشخیص M. bovis و M. bovis BCG از دیگر اعضای کمپلکس MTB بدلیل مقاومت ذاتی (Scorpio A. et al., 1997) آنها به آنتی بیوتیک پیرازینامید[12] از اهمیت راهبردی برخوردار است .(Jure´en P. et al., 2008)این در حالی است که مقاومت به پیرازینامید در مایکوباکتریومهای غیر کمپلکس MTB عمومیت ندارد .(Sun Z. et al., 1997) پیرازینامید جزو داروهای خط اول مقابله با بیماری سل و قادر به از بین بردن باکتری های غیر فعال و احتمالا داخل سلولی است. این خصوصیات امکان کاهش زمان درمان از ۱۲-۱۸ ماه به ۶ ماه را امکان پذیر می کند (Lee K.W. et al., 2001).
روشهای کلاسیک افتراقM. tuberculosis و M. bovis و تستهای حساسیت به دارو بر پایه احیای نیترات[13]، فعالیت آنزیم پیرازینامیداز (Pyrazinamide)، تجمع نیاسین و رشد در محیط تیوفن ۲-کربوکسیلیک اسید هیدرازید[14] استوار است .(Monteros L. et al., 1998)
تعداد صفحه : 116
قیمت :14700 تومان
بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد
و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.
پشتیبانی سایت : * serderehi@gmail.com
در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.
[add_to_cart id=151707]