دانشکده شیلات و محیط زیست
پایان نامه جهت اخذ درجه کارشناسی ارشد در رشته
شیلات، گرایش بوم شناسی آبزیان شیلاتی
بررسی تنوع ژنتیکی شگماهی خزری -Alosa braschnikowi broodine, 1904- در سواحل جنوبی دریای خزر با استفاده از نشانگر ریزماهواره
تحقیق و پژوهش:
امید جعفری
استاد راهنما:
دکتر علی شعبانی
استاد مشاور:
دکتر حامد کلنگی میاندره
تابستان 1393
تعهدنامه پژوهشی
نظر به اینکه انجام فعاليتهاي پاياننامههاي تحصیلی با بهرهگیری از حمایت‌های علمی، مالی و پشتیبانی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان صورت میپذیرد، به منظور رعايت حقوق دانشگاه، نسبت به رعايت موارد زير متعهد ميشوم:
این گزارش حاصل فعالیتهای علمی- پژوهشی و دانش و آگاهی نگارنده است مگر آنکه در متن به نویسنده یا پدید آورنده اثر ارجاع داده شده باشد.
چاپ هر تعداد نسخه از پاياننامه با كسب اجازه کتبی از مديريت تحصيلات تكميلي دانشگاه خواهد بود.
انتشار نتایج پاياننامه به هر شکل (از قبیل کتاب، مقاله و همايش) با اطلاع و كسب اجازه کتبی از استاد راهنما خواهد بود. نام کامل دانشگاه:
به فارسی: دانشگاه علوم كشاورزي و منابع طبيعي گرگان
و به انگلیسی: Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources
در بخش آدرسدهی درج خواهد شد.
در انتشار نتایج پاياننامه در قالب اختراع، اكتشاف و موارد مشابه، نام کامل دانشگاه علوم كشاورزي و منابع طبيعي گرگان به عنوان عضو حقوقی در انتهای فهرست اسامی درج گردد.
تعیین ترتیب اسامی نویسندگان در انتشار نتایج مستخرج از پایاننامه و هر گونه تفاوت احتمالی در آن با فهرست مصوب اسامی هیات راهبری پایاننامه با تایید استاد راهنمای اول خواهد بود.
اینجانب اميد جعفري دانشجوی رشته شیلات، گرایش بوم‌شناسی آبزیان شیلاتی مقطع کارشناسی‌ارشد تعهدات فوق و ضمانت اجرایی آن را قبول کرده و به آن ملتزم می‌شوم.
نام و نام خانوادگی و امضاء
تقدیم به
روح پاک پدر بزرگوارم،
وجود نازنین مادر مهربانم
و
برادران عزیزتر از جانم
تشکر و قدردانی
سپاس و ستایش مر خدای را جل و جلاله که آثار قدرت او بر چهره روز روشن، تابان است و انوار حکمت او در دل شب تار، درفشان. آفریدگاری که خویشتن را به ما شناساند و درهای علم را بر ما گشود و عمری و فرصتی عطا فرمود تا بدان، بنده ضعیف خویش را در طریق علم و معرفت بیازماید.
شايسته است از استاد گرانقدرم جناب آقاي دكتر علی شعبانی بعنوان استاد راهنمای پایان نامه که، همواره با شکیبایی و درایت فراوان، مرا مستفیض راهنماییهای بیدریغ و ذیقیمت خود نمودند، تقدیر و تشکر نمایم.
از استاد مشاور ارجمندم جناب آقاي دكتر حامد کلنگی میاندره به پاس كمك‌هاي بی دریغ ايشان در طي اين مسير صمیمانه سپاسگزارم.
از اساتید محترم ، سرکار خانم ها دکتر حدیثه کشیری و دکتر رقیه صفری که زحمت بازخوانی و داوری این مجموعه را بر عهده داشتند، صمیمانه تشکر و قدردانی می نمایم.
در پایان؛ از خانواده عزیزم که موجب شوق فراگیری بیشتر در من و مسبب اصلی موفقیتهایم میباشند، خالصانه و متواضعانه تشکر مینمایم.
امید جعفری
تابستان 1393
چکیده
شگماهی براشنیکووی (Alosa braschnikowi) یکی از گونههای بومی ماهیان استخوانی حاضر در دریای خزر میباشد که از فراوانی و پراکنش نسبتا بالایی برخوردار است و در سطوح پایین هرم اکولوژیک قراردارد. علیرغم اهمیت اکولوژیکی بالای شگماهیان، هیچگونه اطلاعاتی از ژنتیک جمعیت اعضای جنس Alosa در دریای خزر وجود ندارد. لذا تحقیق حاضر با هدف بررسی تنوع ژنتیکی شگماهی خزری (A. braschnikowi) با استفاده از شش جفت نشانگر ریزماهواره (AsaD030، AsaD042، AsaC051، AsaC059، AsaD312 و AsaD392) در سواحل جنوبی دریای خزر صورتپذیرفت. جهت انجام این تحقیق تعداد 140 عدد ماهی از گونه مورد نظر در پنج منطقه انزلی، گمیشان، محمودآباد، میانکاله و ساری با استفاده از صید پره نمونه برداری شد (هر منطقه 28 عدد) و استخراج DNA بااستفاده از بافت باله دمی صورت گرفت. تمامی جایگاههای ژنی مورد استفاده در این مطالعه به خوبی حالت پلی مورفیسمی نشان دادند. نتایج حاصل از بررسی تنوع ژنتیکی این ماهی نشان داد که میزان متوسط هتروزیگوسیتی مشاهده شده 568/0 بود که مقدار متوسط آن در مناطق انزلی، گمیشان، محمودآباد، میانکاله و ساری به ترتیب 524/0، 518/0، 637/0، 500/0 و 661/0 بهدست آمد. شاخص غنای آللی برای مناطق مورد بررسی 63/12 بهدست آمد. بررسی تعادل هاردی واینبرگ در جمعیتها میزان انحراف بالایی را از تعادل در سطح جایگاهها نشان داد و از بین 30 حالت ممکن (شش جایگاه × پنج جمعیت)، 29 حالت از تعادل خارج بودند و انحراف معنیداری نشان دادند. (05/0P<). میانگین جریان ژنی و ضریب درون آمیزی محاسبه شده بین مناطق به ترتیب 31/9 و 349/0 بود. نتایج حاصل از آنالیز واریانس مولکولی براساس شاخص Fst تنوع ژنتیکی درون مناطق را بالا (96%) و میزان تمایز بین مناطق را نسبتا پایین (4%) نشان داد ولی شاخص Rst توانست تنوع ژنتیکی بالاتری را بین مناطق (40 درصد) نمایش دهد. نتایج بهدستآمده در این مطالعه نشاندهنده غنای آللی نسبتاً مناسب این گونه بوده ولی احتمال در تنگنا قرارگرفتن در آینده به‌خاطر ویژگی گلهای بودن آن وجود دارد. بهنظر میرسد احیای زیستگاهها و جلوگیری از صید ناخواسته بیرویه این گونه میتواند در بالا نگهداشتن اندازه جمعیت مؤثر آن مفید واقع شود.
واژگان کلیدی: آلل، تنوع ژنتیکی، دریای خزر، ژنتیک جمعیت، نشانگر ریزماهواره، Alosa braschnikowi
فهرست مطالب
عنوان صفحه
1- مقدمه2
1-1- کلیات2
2-1- رده‌بندی2
3-1- خصوصیات کلیدی3
4-1- پراکنش و تخمریزی3
5-1- زیستگاه3
6-1- سن و رشد3
7-1- غذا4
8-1- ذخیره4
9-1- مطالعه فرا جمعیتها5
10-1- تنوع ژنتیکی و کمی کردن آن6
11-1- عوامل مؤثر بر تنوع ژنتیکی6
1-11-1- رانش ژنتیکی7
2-11-1- گردنه بطری7
3-11-1- انتخاب طبیعی8
4-11-1- روش تولید مثل8
12-1- انواع نشانگرهای ژنتیکی8
1-12-1- نشانگرهای مورفولوژیکی9
2-12-1- نشانگرهای پروتئینی9
3-12-1- نشانگرهای مولکولی DNA و RNA10
13-1- سنجش فراوانی آللی13
14-1- تغییر فراوانی آللی14
15-1- موازنه هاردي- واينبرگ و دلایل انحراف از آن14
فهرست مطالب
عنوان صفحه
16-1- آماره F16
17-1- فاصله ژنتیکی (Nei, 1978)17
18-1- ضرورت تحقیق18
19-1- اهداف19
20-1- فرضیهها20
1-2- مروری بر مطالعات انجام شده در داخل کشور22
2-2- مروری بر مطالعات انجام شده در خارج از کشور24
3- مواد و روشها30
1-3- نمونه‌برداري30
2-3- استخراج DNA31
3-3- نحوه استخراج DNA33
4-3- مراحل استخراج DNA33
5-3- ارزیابی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده34
6-3- ارزیابی کیفیت DNA با استفاده از الکتروفورز افقی ژل آگارز یک درصد36
7-3- واکنش زنجیرهای پلیمراز37
1-7-3- انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR)37
8-3- بهینه‌سازی PCR38
9-3- الکتروفورز محصول PCR، با استفاده از ژل پلی آکریل آمید 6%38
10-3- روش تهيه ژل آكريل آميد39
11-3- رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید با روش نیترات نقره40
12-3- ثبت تصاویر40
13-3- آنالیز آماری41
فهرست مطالب
عنوان صفحه
4- نتایج44
1-4- نتایج حاصل از بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراجی از شگماهی براشنیکوی در مطالعه حاضر44
2-4- نتایج حاصل از واکنش زنجیرهای پلیمراز45
3-4- فراوانی و تعداد آللها47
4-4- تعداد آللهای واقعی (Na) و مؤثر (Ne)50
5-4- تنوع ژنتیکی51
6-4- شاخص شانون52
7-4- تعادل هاردی- واینبرگ53
8-4- نتایج آزمون واریانس مولکولی (AMOVA)54
9-4- شباهت و فاصله ژنتیکی بر اساس شاخص نئی (Nei Index)56
5- بحث60
1-5- مطالعات تعداد نمونه، روش استخراج DNA و انتخاب نشانگرها60
2-5- مطالعات تنوع ژنتیکی61
3-5- مطالعات مربوط به تعادل هاردی- واینبرگ65
4-5- مطالعات مربوط به تمایز جمعیتی67
5-5- مطالعات مربوط به شباهت و فاصله ژنتیکی68
6-5- نتیجه‌گیری کلی69
7-5- پیشنهادات اجرایی69
8-5- پیشنهادات پژوهشی70
فهرست منابع72
فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
جدول 1-4- جایگاه‌های ژنی مورد استفاده در این مطالعه و خصوصیات آنها45
جدول 2-4- نتایج حاصل از ظرفیت اطلاعات چند شکلی (PIC) نشانگرهای مورد استفاده در مطالعه حاضر45
جدول 3-4- تعداد و وزن آللهای بهدست آمده بر حسب bp در سطح شش جایگاه ژنی مورد استفاده در این مطالعه48
جدول 4-4- فراوانی آللی مشاهده شده در سطح جایگاههای ژنی مورد مطالعه در این تحقیق49
جدول 5-4- تعداد آللهای واقعی (Na) و مؤثر (Ne) در سطح جایگاههای ژنی مورد بررسی در پنج منطقه پراکنش شگماهی براشنیکووی (A. braschnikowi)50
جدول 6-4- مقادیر هتروزیگوسیتی مشاهده شده (Ho) و مورد انتظار (He) جمعیتهای مورد مطالعه در ماهی A. braschnikowi در سطح جایگاههای ژنی مورد بررسی51
جدول 7-4- میانگین مقادیر هتروزیگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار ±خطای استاندار در مناطق مورد مطالعه از ماهی A. braschnikowi52
جدول 8-4- مقادیر محاسبه شده شاخص شانون برای مناطق مورد بررسی در ماهی A. braschnikowi در سطح جایگاهها52
جدول 9-4-مقادیر محاسبه شده در بررسی تعادل هاردی- واینبرگ در مناطق مورد بررسی در شش جایگاه ژنی53
جدول 10-4- آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) تحت معیار Fst54
جدول 11-4- آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) تحت معیار Rst54
جدول 12-4- مقادیر Fst محاسبه شده بین مناطق بر اساس آنالیز واریانس مولکولی55
جدول 13-4- مقادیر Rst محاسبه شده بین مناطق بر اساس آنالیز واریانس مولکولی55
جدول 14-4- مقادیر بهدستآمده از ضرایب تمایز (Fst) و درونآمیزی (Fis) در سطح جایگاه‌های ژنی مختلف در مطالعه حاضر55
فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
جدول 15-4- مقادیـر جریـان ژنـی (Nm) مشـاهده شـده بین مناطـق مورد بررسی در ماهی A. braschnikowi56
جدول 16-4- ماتریکس فاصله و شباهت ژنتیکی بر اساس شاخص نئی (نئی، 1972)56
جدول 17-4- خلاصهای از نتایج تخصیص جمعیتها به خود و دیگر مناطق57
فهرست شكل‌ها
عنوان صفحه
شکل 1-3- نقشه مناطق نمونه برداری ماهی A. braschnikowi در سواحل جنوبی دریای خزر در مطالعه حاضر30
شکل 2-3- تصویر بیوفتومتر مورد استفاده در مطالعه حاضر35
شکل 3-3- تصویر دستگاه الكتروفورز افقي37
شکل 4-3- تصویری از دستگاه الكتروفورز عمودي مورد استفاده در مطالعه حاضر39
شکل 5-3- تصویری از دستگاه مستند ساز ژل41
شکل 1-4- تصویری از ژل آگارز یک درصد و باندهای تشکیل شده از DNA بر روی آن44
شکل 2-4- تصویر باندهای DNA ثبت شده توسط نشانگر EF014998 بر روی ژل اکریل آمید در ماهی A. braschnikowi46
شکل 3-4- تصویر باندهای DNA ثبت شده توسط نشانگر EF015000 بر روی ژل اکریل آمید در ماهی A. braschnikowi46
شکل 4-4- تصویر باندهای DNA ثبت شده توسط نشانگر EF014992 بر روی ژل اکریل آمید در ماهی A. braschnikowi46
شکل 5-4- تصویر باندهای DNA ثبت شده توسط نشانگر EF014993 بر روی ژل اکریل آمید در ماهی A. braschnikowi46
شکل 6-4- تصویر باندهای DNA ثبت شده توسط نشانگر EF014999 بر روی ژل اکریل آمید در ماهی A. braschnikowi47
شکل 7-4- تصویر باندهای DNA ثبت شده توسط نشانگر EF015004 بر روی ژل اکریل آمید در ماهی A. braschnikowi47
شکل 8-4- نمودار گرافیکی جدایی مناطق مورد بررسی در مطالعه حاضر57
شکل 9-4- دندروگرام UPGMA نمونههای جمعآوری شده شگماهی براشنیکووی از مناطق مختلف بر اساس معیار شباهت ژنتیکی (نئی، 1978)58

فصل اول
مقدمه
1- مقدمه
1-1- كليات
دریای خزر باقیمانده دریای تتیس، به عنوان بزرگترین دریاچه جهان تعداد زیادی از گونههای آبزی را در خود جای داده است و حفظ این گونهها به پایداری این اکوسیستم کمک شایانی مینماید. تنوع ژنتیکی به عنوان یکی از سه سطح تنوع زیستی، بهعنوان پایهای و کلیدیترین بخش در سلسله مراتب تنوع نقش ایفا میکند. یکی از خانوادههای مهم ماهیان در دریای خزر، خانوده شگ ماهیان (Clupeidae) است که به فراوانی در سرتاسر دریای خزر پراکنش یافته است (پاتیمار و همکاران، 2013). این خانواده در دریای خزر شامل دو جنس بوده که از جنسهای معروف آن میتوان به جنس Alosa با بیشتر از چهار گونه در آبهای دریای خزر اشاره کرد (عبدلی و نادری، 2008). شگماهی براشنیکووی (Alosa braschnikowi Borodin, 1904) از جمله ماهیان استخوانی حاضر در این دریاست که از تراکم و پراکنش نسبتاً مناسبی برخوردار است و بومی این دریا محسوب میشود و معمولاً در صیدهای پره به عنوان صید ضمنی مشاهده میگردد ولی در خارج از فصل صید پره با استفاده از تورهای گوشگیر نیز صید میشود. شگماهیان بطور عمده پلانکتون‌خوار بوده و نقش مهمی را در هرم اکولوژیک اکوسیستم دریای خزر به عنوان بزرگترین دریاچه جهان بازی میکند (عبدلی و نادری، 2008).
2-1- رده بندی
رده: Actinopterygii
راسته: Clupeiformes
خانواده: Clupeidae
جنس: Alosa
گونه: Alosa braschnikowi
اسم فارسی: شگماهی براشنیکووی، شگماهی خزری
اسم انگلیسی: Caspian marine shad, braschnikowi shad
3-1- خصوصیات کلیدی
این گونه با بدن نسبتا کشیده و گرد به شکل بدن هرینگ مرتبط میشود ولی نه به عمیقی بدن برخی گونههایی که به شکل هرینگ مرتبط میشوند. خارهای آبششی کوتاه و به تعداد 18 تا 49 عدد میباشد و دندانها به خوبی در آروارهها توسعه یافتهاند. طول استاندارد بدن به 50 سانتی متر میرسد ولی میانگین طول بدن 27 تا 34 سانتی متر میباشد (کد، 2013).
4-1- پراکنش و تخمریزی
این گونه در فصل زمستان بطور عمده در جنوب دریای خزر پراکنش دارد و در فصل بهار جهت تخمریزی به قسمتهای شمالی مهاجرت میکند و از نظر جغرافیای زیستی محدود به دریای خزر است (کد، 2013).
5-1- زیستگاه
در فصل زمستان این گونه به سمت آبهای عمیقتر به طرف سواحل ایران حرکت میکند. در ماه فروردین به سمت آبهای ساحلی لبشور نزدیک میشود ولی هرگز وارد آبهای شیرین نمیشود (ویتچانین، 1984) و همچنین این گونه هرگز وارد رودخانهها در بخش جنوبی دریای خزر نمیشود (جلودار و عبدلی، 2004). این گونه تا شوری بالای 6/47 درصد نیز زنده میماند. محل تخمریزی و تغذیه برای برخی جمعیتها در بخش شمالی دریای خزر است ولی مراحل دیگر سیر زندگی در بخش جنوبی دریای خزر است و اندازه کوچکی دارند.
6-1- سن و رشد
اعضای این گونه در سن 2 تا 5 سالگی به بلوغ میرسند و طول عمر به نزدیک 10 سال میرسد؛ اگرچه در زیرگونهها میتواند متفاوت باشد. اکثر فرمهای خزر جنوبی در سن 2 سالگی به بلوغ می‌رسند (اسویتوویدو، 1952). همچنین نرخ رشد در بین زیرگونهها متفاوت است. به عنوان مثال زیرگونه oriental یکی از کم سرعتترین زیرگونهها از نظر رشد است و سن آن تا 10 سال میرسد.
7-1- غذا
از نظر غذایی به ماهیان کوچک و یا مراحل لاروی ماهیان، میگوها و نرمتنان وابسته بوده و رژیم تغذیهای آن در زمستان شامل85 درصد کیلکا (Clupeonella engrauliformis)، برخی گاوماهیان (Neogobius) و میگو بوده و در فصل بهار عمدتا از کیلکای معمولی خزری (Clupeonella caspia)، شیشهماهیان (Atherina boyeri) و میگو تغذیه مینماید (کد، 2013).
8-1- ذخیره
ذخیره به عنوان مجموعهای از افراد در نظر گرفته میشود که در یک منطقه جغرافیایی مشابه زندگی میکنند و همه اعضای آن به یک ذخیره ژنی تعلق داشته و وقتی بالغ میشوند با یکدیگر جفتگیری میکنند. مدیریت مؤثر منابع شیلاتی مستلزم دانش و آگاهی کافی است. به عنوان مثال، آگاهی از مواردی چون اندازه جمعیت، ترکیب سنی افراد، الگوی زادآوری گونهها، نرخ مرگ و میر طبیعی و صیادی و بسیاری دیگر برای مدیریت پایدار ضروری است. از مهمترین سؤالات در این زمینه میتوان به مواردی چون، آیا گونه مورد بررسی به عنوان یک واحد ژنتیکی مجزا وجود دارد یا به‌صورت مجموعهای از گروههای ژنتیکی نسبتاً جدا از هم هستند؟ و آیا گونه مورد بررسی از نظر ژنتیکی، همسان است یا خیر؟ اشاره کرد. از نظر مدیران صیادی واژه ذخیره به گروهی از آبزیان اطلاق میشود که با استفاده از یک روش خاص مورد بهره برداری قرار گرفته و یا این که در یک منطقه خاص وجود دارند. اگرچه این مفهوم ممکن است جهت تجزیه و تحلیل میزان صید و تلاش صیادی و همچنین اجرای اقدامات مدیریتی نظیر تعیین سهمیه صید و اندازه تورهای ماهیگیری مناسب باشد، ولی ارتباط چندانی با گروههای مختلف یک گونه که از نظر ژنتیکی متمایز باشند، ندارد. در میان برخی گونهها (یا در بخشی از محدوده آنها) ممکن است گروههای ژنتیکی کاملاً تمایز یافته دیده شوند در حالیکه در بین سایر گونهها (یا در سایر بخشهای محدوده آنها) ممکن است گروهها از نظر ژنتیکی غیرقابل تمایز باشند. بنابراین استفاده صرف از یک واژه نظیر ذخیره برای توصیف واحدهایی از افراد نادرست است. در این موارد از واژه «جمعیت» برای نامگذاری یک گروه درونگونهای که افراد آن با هم دارای آمیزش تصادفی هستند و در یک ناحیه جغرافیایی معین و یا در یک زمان معین وجود دارند، استفاده میشود (کیوانشکوه و درافشان، 1389).
9-1- مطالعه فرا جمعیتها
بطور کلی جمعیت به گروهی متشکل از افراد یک گونه که قادر به تولید مثل با یکدیگر بوده و در محدوده جغرافیایی محدود و مشخصی زیست میکنند، گفته میشود. از نظر تئوری این تعریف بسیار ساده و مشخص به نظر میرسد اما در عمل دلایل متعددی وجود دارد که نمیتوان به سادگی محدوده و مرز جمعیتها را مشخص کرد. به عنوان مثال یکی از عوامل گمراه کننده ممکن است این باشد که جمعیتهای یک گونه به صورت گروههابی مختلف در زمانهای مختلف در طول یک سال زیست میکنند. برای تفسیر نتایج حاصل از دادههای ژنتیکی در سطح بوم شناسی باید بدانیم که ژنتیک جمعیتها تحت تأثیر فرایندهای درون جمعیتی و بین جمعیتی است. به استثنای گونههای نادر و در معرض خطر انقراض که پراکنش محدودی دارند، مطالعه سایر گونهها نشان داده است که در عمل بین جمعیتها تفاوتهای ژنتیکی وجود دارد. عدم وجود تفاوت بین جمعیتها بدین معناست که همه آن جمعیتها دارای فراوانی آللی یکسانی هستند. چنین شرایطی در صورتی امکانپذیر است که همه افراد یک گونه در یک جمعیت بزرگ که بطور تصادفی تولید مثل میکند، متمرکز شده باشند. بنابراین در گونههایی که از چندین جمعیت تشکیل شده است معمولاً چنین حالتی وجود ندارد. یک نمونه استثنایی بر این قاعده که بسیار مورد توجه قرار گرفته است جمعیتهای مارماهی اروپایی (Anguilla anguilla) میباشد. جمعیتهای این گونه در مناطق جغرافیایی مختلف زمستان گذرانی کرده و سپس برای تولید مثل در تابستان به دریای سارگاسو مهاجرت میکنند. وجود یک منطقه مشترک تولید مثلی به این گونه اجازه میدهد که با افراد مختلف بطور تصادفی تولید مثل نموده و ژنهای موجود در این جمعیت بطور یکنواخت پراکنده شوند. بههمین دلیل، با استفاده از ژنهای میتوکندری و آلوزایم ساختار ژنتیکی خاصی در این جمعیتها مشهود نیست (آویس و همکاران، 1986). در سالیان اخیر محققان با استفاده از هفت لوکوس ریزماهواره توانستند تفاوتهای ژنتیکی بین گروههای مارماهی زمستانگذران را در چندین منطقه مطالعه کنند. تشخیص تقسیم شدگی یک جمعیت به چندین زیر جمعیت معمولاً دشوار است، اما با استفاده از روشهای مولکولی و انتخاب نشانگر مناسب میتوان اطلاعات ارزشمندی به‌دست آورد (ویرس و برناچز، 2001).
10-1- تنوع ژنتیکی و کمی کردن آن
تنوع ژنتیکی بهعنوان پایهترین اصل در سلسله مراتب تنوع زیستی نقش ایفا میکند. این طبقه از تنوع دربرگیرنده جمعیتهای متمایز از یک گونه میباشد و یا تفاوتهای ژنتیکی افراد داخل یک جمعیت را نشان میدهد. به بیان دیگر تنوع ژنتیکی بیان کننده تفاوت در تعداد و نوع آللهای موجود در لوکوسهای کروموزومی است و به دلیل نقش کلیدی که در ساختار ذخایر طبیعی ماهیان دارد، طی سالیان اخیر علاقه مندان زیادی را در مباحث مطالعات جمعیتی به خود جلب کرده است. محیطها همواره در حال تغییرند و تنوع ژنتیکی برای تداوم تکامل و سازگاری گونهها برای زیست در شرایط جدید لازم است. علاوه براین تنوع ژنتیکی اندک منجر به افزایش درون آمیزی شده که میتواند برازندگی افراد و جمعیتها را کاش دهد. بنابراین ارزیابی تنوع ژنتیکی موجود در یک جمعیت از مهمترین اهداف در مطالعه ژنتیک جمعیتهاست و کاربرد بسیار مهمی در زیستشناسی حفاظت دارد. تنوع ژننتيكي را میتوان در سطوح مختلف بررسی و اندازهگیری نمود. یکی از این سطوح، تعیین توالی قطعهای از DNA و بررسی تفاوت آن در میان افراد مختلف است. همچنین میتوان تفاوتهای پروتئینی که نتیجه وجود تنوع در توالیهای رمز کننده DNA است را مورد بررسی قرار داد. گاهی اوقات از تفاوتهای فنوتیپی موجودات که نتیجه تنوع ژنتیکی در تنها یک یا دو جایگاه هستند، به این منظور استفاده میشود (کیوانشکوه و درافشان، 1389).
11-1- عوامل مؤثر بر تنوع ژنتیکی
تنوع ژنتیکی تحت تأثیر عوامل متعددی است و این عوامل در جمعیتهای مختلف متفاوت است. از مهمترین عوامل تعیین کننده تنوع ژنتیکی میتوان مواردی نظیر رانش ژنتیکی1، گردنه بطری2، اتخاب طبیعی و روش تولید مثل را نام برد. باید توجه داشته باشیم که هیچ فرایندی بهصورت مستقل عمل نمیکند. بهعنوان مثال، هنگامی که یک جمعیت یک گردنه بطری را پشت سر گذاشت، بازسازی آن جمعیت به بومشناسی تولیدمثل آن بستگی دارد. از طرفی دیگر مشخص کردن مقدار تأثیر یک پدیده بر تنوع ژنتیکی یک جمعیت ساده نیست؛ چراکه هیچ دو جمعیتی مانند یکدیگر نیستند. در ادامه این عوامل مورد بحث قرار میگیرند.
1-11-1- رانش ژنتیکی
رانش ژنتیکی پدیدهای است که باعث تغییر فراوانی آللی از یک نسل به نسل بعدی در اثر پدیده‌های تصادفی میشود. این پدیده به دلیل این که موفقیت تولید مثلی در یک جمعیت متغییر است و برخی از افراد زادگان بیشتری نسبت به سایرین تولید میکنند، اتفاق میافتد. بنابراین تعداد آللهای تولید شده در جمعیت یکسان نخواهد بود و در نتیجه در فراوانی آللها در جمعیت از نسلی به نسل بعدی تفاوت مشاهده میشود. این پدیده به دلیل تصادفی بودنش باعث تغییر در ویژگیهای تکاملی غیر سازشی جمعیتها میشود. اهمیت رانش ژنتیکی در جمعیتهای کوچک بسیار بیشتر است چراکه در فقدان اثر انتخاب طبیعی در انتخاب آللها، رانش ژنتیکی میتواند در مدت زمان کوتاهی به تثبیت یک آلل یا انقراض آن در جمعیت بیانجامد و در نتیجه تنوع ژنتیکی کل آن جمعیت را کاهش دهد. در واقع رانش ژنتیکی در ارتباط مستقیم با اندازه مؤثر جمعیت قراردارد. تأثیر رانش ژنتیکی بر جمعیت‌های بزرگ نیز در طولانی مدت میسر خواهد بود (ملکیان، 1389).
2-11-1- گردنه بطری3
پدیده گردنه بطری باعث کاهش اندازه جمعیت مؤثر و در نتیجه کاهش تنوع ژنتیکی جمعیتها میشود. روشهایی که برای کمی کردن تأثیر گردنه بطری بر روی اندازه جمعیت مؤثر و تنوع ژنتیکی وجود دارند، نیازمند دادههای دموگرافی درازمدت میباشند. از آنجا که این گونه دادهها به ندرت در دسترس هستند، محققان معمولاً احتمال وجود ارتباط بین گردنه بطری و تنوع ژنتیکی جمعیت را از روی مشاهده تنوع ژنتیکی بسیار کم در یک جمعیت حدس زده و سپس تصمیم میگیرند که آیا می‌توان تنوع ژنتیکی اندک جمعیت در شرایط کنونی را بهوجود یک گردنه بطری در گذشته جمعیت مرتبط دانست یا نه. تشخیص گردنه بطری همچنین بهدلیل اینکه همه پارامترهایی که ما با آن تنوع ژنتیکی را اندازهگیری میکنیم، کاهش یکسانی را نشان نمیدهند، پیچیدهتر میشود. از طرف دیگر آللهای نادر بهدنبال گردنه بطری از بین میروند و این خود باعث کاهش تنوع آللی میشود (لوکارت و کورنوئیت، 2002).
3-11-1- انتخاب طبیعی
تنوع ژنتیکی همچنین تحت تأثیر انتخاب طبیعی قرار دارد. فرایندی که منجر به تفاوتهای تولید مثلی افراد متمایز از نظر خصوصیات ژنتیکی با ژنوتیپهای متمایز میشود. انتخاب طبیعی بر فراوانی آللی تأثیر میگذارد و میتواند باعث افزایش یا کاهش آن شود (لی، 1997). گزینش پایداری بخش4 و گزینش جهتدار5 هر دو معمولاً باعث کاهش تنوع ژنتیکی میشوند. گزینش جهتدار مثبت میتواند باعث افزایش تنوع ژنتیکی بهطور موقتی شود. این پدیده را چندشکلی گذرا6 گویند.
4-11-1- روش تولید مثل
بررسی روند تغییرات و عواملی که بر تنوع ژنتیکی اثر میگذارند بدون بررسی نقش روند تولید مثلی کامل نیست. مهمترین مزیت تولید مثل جنسی وجود نوترکیبی در تولید مثل جنسی است. نوترکیبی باعث ایجاد ژنوتیپهای جدیدی میشود که توانایی بالقوه جهت سازگاری با محیط متغیر را فراهم میکند. تولید سریع تنوع ژنتیکی از طریق نوترکیبی بدین معناست که جمعیتهایی که به روش جنسی تولید مثل میکنند معمولاً دارای تنوع ژنتیکی بالاتری در مقایسه با جمعیتهایی هستند که تولید مثل غیر جنسی دارند (لی و همکاران، 2007).
12-1- انواع نشانگرهای ژنتیکی
بطور کلی هر صفتی که بین افراد متفاوت باشد، ناشی از تفاوت موجود بین ردیف DNA کروموزومهای آنهاست که به نتاج نیز منتقل میشود. حتی صفاتی که تحت تأثیر شرایط محیط نیز بصورت متفاوت بروز میکنند (تفاوت در بین افراد در شرایط محیطی یکسان)، بازتاب تفاوتهای موجود در ردیفهای DNA هستند. این تفاوتها میتوانند به عنوان نشانه یا نشانگر ژنتیک استفاده شوند. بهطور کلی برای آنکه صفتی بهعنوان نشانگر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد باید حداقل دو ویژگی زیر را داشته باشد:
الف- در بین دو فرد متفاوت باشد (چند شکلی7 نشان دهد)؛
ب- به توارث برسد.
1-12-1- نشانگرهای مورفولوژیکی
کاربرد نشانگرهای ژنتیک به دهها سال پیش از کشف DNA، به عنوان ماده ژنتیک، مربوط میشود. نشانگرهای مورفولوژیکی که پیامد جهشهای قابل رویت در مورفولوژی سازوارهاند، از ابتدای این سده مورد استفاده بودهاند. صفات مورفولوژیکی که عمدتا توسط یک ژن کنترل میشوند، میتوانند به عنوان نشانگرهای ژنتیک مورد استفاده قرار گیرند. این نشانگرها شامل دامنه وسیعی از ژنهای کنترل کننده صفات فنوتیپی هستند و جزو نخستین نشانگرها بهشمار میآیند. این نوع نشانگرها دارای معایب زیادی از جمله موارد زیر هستند (نقوی و همکاران، 1386):
اغلب دارای توارث غالب و مغلوب بوده و اثرات اپیستازی و پلیوتروپی8 دارند؛
تحت تاثیر شرایط محیطی و مرحله رشد موجود قرار میگیرند؛
فراوانی و تنوع کمی دارند؛
گاهی برای مشاهده و ثبت آنها باید منتظر ظهور آنها ماند؛
اساس ژنتیک بسیاری از نشانگرهای مورفولوژیک هنوز مشخص نشده است.
2-12-1- نشانگرهای پروتئینی
در دهه 1950، نشانگرهای مولکولی قابل مشاهده توسط الکتروفورز پروتئینها تحول شگرفی را ایجاد نمودند. معمولترین نوع نشانگرهای پروتئینی آیزوزایمها/ آلوزایمها هستند که فرمهای مختلف یک آنزیم را نشان میدهند. برخی از تفاوتهای موجود در ردیف DNA بین دو موجود ممکن است بهصورت پروتئینهایی با اندازههای مختلف تجلی کنند که به روشهای مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و رویت و مطالعه میگردند. این قبیل نشانگرها را نشانگرهای مولکولی در سطح پروتئین مینامند که از آن جمله میتوان به سیستم آیزوزایم اشاره کرد. نشانگرهای پروتئینی تغییرات را در سطح ردیف و عمل ژن بهصورت نشانگرهای همبارز نشان میدهند. از معایب این نشانگرها محدود بودن آنهاست. همچنین این نشانگرها تحت تاثیر تغییرات پس از ترجمه قرار دارند. روشهای رنگآمیزی پروتئینها در مورد آیزوزایمها چندان زیاد نیست، تعداد آیزوزایمهای قابل ثبت و مشاهده که میتوان از آنها به‌عنوان نشانگر استفاده کرد، به یکصد عدد نمیرسد. این محدودیت در تعداد نشانگرهای آیزوزایم از عمدهترین معایب آنهاست و موجب کاهش کارایی آنها میشود. از نکات منفی دیگر این نشانگرها، محدودیت تنوع ژنتیکی قابل ثبت در آیزوزایمهاست.
پیشرفتهایی که در زمینه الکتروفورز دو بعدی با قدرت تفکیک زیاد پدید آمد و تجزیه و تحلیل همزمان هزاران پروتئین را میسر ساخته، موجب شده که نشانگرهای پروتئینی جایگاه از دست رفته خود را دوباره بازیابند. تاثیرپذیری نشانگرها از محیط که بطور معمول بهعنوان یکی از محدودیتها و نکات منفی نشانگرهای مولکولی یاد میشود، در مورد این نشانگر تبدیل به برتری شده و جایگاه متمایزی را در بین سایر نشانگرها به ارمغان آورده است (نقوی و همکاران، 1386).
3-12-1- نشانگرهای مولکولی DNA و RNA
دستهای دیگر از تفاوتهای موجود در سطح DNA هیچ تظاهری ندارند؛ صفت بخصوصی را کنترل نمیکنند و در ردیف اسیدهای آمینه تاثیری برجای نمیگذارند. این نشانگرها که تعدادشان تقریبا نامحدود است، فقط از راه تجزیه و تحلیل مستقیم DNA قابل ثبت هستند و از اینرو به آنها نشانگرهای مولکولی در سطح DNA گفته میشود. کشف انواع آنزیمهای محدودگر9 توسط اسمیت و ویلکوکس (1970)، همچنین کشف واکنش زنجیرهای پلیمراز10 (PCR) توسط مولیس و فالونا (1987) فرصت مناسبی را برای بررسی تنوع و تفاوت موجودات مختلف در سطح DNA امکان پذیر کرده است. همچنین به کمک این نشانگرها ایجاد نقشههای فیزیکی و ژنتیکی در موجودات زنده و همچنین شناسایی ژنهای کنترل کننده صفات کیفی و کمی امکانپذیر شده است. این نشانگرها از نظر بسیاری از ویژگیها مانند درجه چند شکلی، غالب یا همبارز بودن، تعداد جایگاههای تجزیه شده در هر آزمایش، توزیع در سطح کروموزوم، تکرار پذیری، نیاز یا عدم نیاز به توالی‌یابی DNA الگو و هزینه مورد نیاز با همدیگر متفاوتند. انتخاب بهترین نشانگر به هدف مطالعه (انگشت نگاری11، تهیه نقشه پیوستگی12، ژنتیک جمعیت و روابط تکاملی) و سطح پلوئیدی موجود مورد بررسی بستگی دارد.
بدون تردید، ابداع و معرفی واکنش زنجیرهای پلی مراز (PCR) بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است. واکنش زنجیرهای پلیمراز یک روش سریع تکثیر آزمایشگاهی قطعه یا قطعههای مورد نظر DNA است و نشانگرهای DNA را از نظر وابستگی به انجام PCR به دو دسته نشانگرهای DNA مبتنی بر PCR و نشانگرهای غیر مبتنی بر PCR تقسیم بندی مینمایند.
1-3-12-1- نشانگرهای ریزماهواره
ریز ماهوارهها توالی‌هایی از DNA هستند که شامل واحدهای کوتاه پشت سر هم تکرار شونده از 1 تا 6 جفت باز (bp) در طول DNA می باشند. معمولاً طول ردیفهای تکرارشونده بین 20 و در مواردی تا 100 جفت باز بوده است و توسط دو ردیف منحصر به فرد در دو طرف محدود شدهاند (لو و همکاران، 2003). برخی منابع تعداد واحدهای کوتاه تکرار شونده در ریزماهوارهها را 1 تا 4 و حداکثر تا 150 جفت باز اعلام نمودهاند (نف و گروس، 2001). ریزماهوارهها به سه گروه عمده تکرارهای کامل، تکرارهای ناکامل (معمولا توسط بازهای غیر تکرارشونده قطع میشوند) و تکرارهای مرکب (دو یا تعداد بیشتری از واحدهای تکراری مجاور یکدیگر) تقسیم میشوند. حداقل تعداد واحد تکرارشونده برای ریزماهوارههای دو نوکلئوتیدی و سه نوکلئوتیدی به ترتیب 10 و هفت بار تکرار تعیین شدهاست. ریزماهوارهها یا ردیفهای تکراری ساده (SSR) گروهی از ردیفهای تکرارشوندهاند که با نامهای مختلف همچون تفاوت طول ردیفهای ساده13 (SSLPs)، ردیفهای کوتاه تکراری14 (STRs)، موتیفهای با ردیف ساده15 (SSMs) و نقاط ریزماهواره نشانمند از ردیف16 (STMs) نیز خوانده میشوند. ردیفهای ریزماهوارهای غیرپایدارند و با کاهش یا افزایش واحدهای تکرارشونده دچار تغییرات فراوان در طول میشوند. تنوع در تعداد تکرارهای ریزماهوارهها که به کمک PCR و الکتروفورز قابل آشکار سازیاند، موجب شده است که از ریزماهوارهها به عنوان ابزار مولکولی با پتانسیل بسیار زیاد برای تشخیصهای ژنومی در آزمایشگاهها استفاده شود. فراوانی ردیفهای کوتاه تکرار شونده در ژنوم سازوارههای مختلف، اعم از یوکاریوتها و تاحدی پروکاریوتها به اثبات رسیده است. این ریزماهوارهها با روشهای پیچیده زیستشناسی مولکولی و با هزینه زیاد شناسایی و ردیفهای مجاور آنها تعیین میشوند. سپس براساس ردیف احاطه کننده هر ریزماهواره آغازگرها طراحی و ساخته میشود. از طریق واکنش زنجیرهای پلیمراز و با استفاده از این گونه آغازگرها می‌توان DNA ژنومی نمونههای مختلف را برای تکثیر ریزماهوارههای مذکور مورد استفاده قرار داد (نقوی و همکاران، 1386).
1-1-3-12-1- مزایای ریزماهوارهها
الف- کاربرد آنها و تفسیر نتایج نسبتا ساده است؛
ب- سیستم چند آللی از ویژگیهای بارز این نشانگر است؛
ج- ریزماهوارهها بسیار متنوعاند؛
د- به وفور در ژنوم یوکاریوتها یافت میشوند؛
ه- بیشتر ریزماهوارهها غیر عملکردی17 هستند؛
و- همبارز هستند، یعنی هر دو آلل قابل تشخیص میباشند (لی و همکاران، 2007).
2-1-3-12-1- معایب ریزماهوارهها
الف- شناسایی ریزماهوارهها، تعیین ردیف بازی آنها، طراحی و ساخت آغازگرها و تهیه نقشه ژنتیک ریزماهوارهها که مقدمه کاربرد این نشانگرهاست، بسیار پیچیده و مستلزم صرف وقت و هزینه بسیار زیاد است؛
ب- در صورت توزیع نامناسب ریزماهوارهها در طول ژنوم کاربرد مؤثر آنها در مکان‌یابی ژنها محدود میگردد؛
ج- کمبود تعداد ریزماهوارههای شناخته شده در برخی از موجودات استفاده از آنها را در مکان یابی ژنها محدود کرده است (نقوی و همکاران، 1386).
13-1- سنجش فراوانی آللی
جمعیت را میتوان بهعنوان خزانهای از آللها در نظر گرفت. فراوانی آللی عبارت است از محاسباتی که طی آن مشخص میکنیم یک آلل فراوان یا نادر بوده و در چند درصد از یک جمعیت حضور دارد. در یک سیستم دو آللی فراوانی آلل غالب (A) را با p و فراوانی آلل مغلوب (a) را با q نشان میدهیم. بنابرین چون فقط دو آلل وجود دارد در نتیجه 1p+q=. اگرچه یک فرد دیپلوئید در هر جایگاه تنها دارای دو آلل است ولی در یک جمعیت ممکن است آللهای متفاوت دیگری برای آن جایگاه وجود داشته باشد. محاسبه فراوانی آللها در مطالعات ژنتیک جمعیت ضروری است. فراوانی ژنوتیپی که تحت عنوان نسبت حضور هر یک از ژنوتیپها در یک جمعیت تعریف میشود نیز باید معادل 1 باشد. یعنی فراوانی حضور ژنوتیپها (AA، Aa، aa) باید مساوی 1 باشد. محاسبه فراوانی آللی با استفاده از رابطه زیر محاسبه میشود:

P = 2Ho + He / 2N
كه Ho = تعداد افراد هموزيگوت‌ها براي آن آلل، He = تعداد هتروزيگوت‌ها براي آلل و N = تعداد نمونه‌هاي رتبه‌بندي شده در لكوس است.
در صورت عدم وجود عوامل برهم زننده تعادل اجزای مدل هاردی- واینبرگ، فراوانی آللی از یک نسل به نسل دیگر ثابت باقی میماند. پیشبینی فراوانیهای ژنوتیپی براساس مدل هاردی- واینبرگ تنها زمانی امکانپذیر است که افراد دارای آمیزش تصادفی بوده و والدین سهم یکسانی در به اشتراک گذاشتن گامتها داشته باشند و ترکیب گامتها نیز بهصورت تصادفی انجام شود. در ماهیان و سایر آبزیان معمولاً نمونهبرداری در افراد بالغ صورت میگیرد. گزینش و مهاجرت دو عامل مهم ایجاد انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ در جمعیت بالغ ماهیان و آبزیان هستند. علاوه بر این گونههای نادر ماهیان و سایر آبزیان بهصورت نسلهای مجزا از هم زندگی مینمایند و اغلب جمعیتها، ترکیبی از افراد نسلهای مختلف هستند که با یکدیگر همپوشانی دارند (ملکیان، 1389).
14-1- تغییر فراوانی آللی
چنانچه در یک جمعیت تعادل هاردی- واینبرگ برقرار باشد؛ فراونیهای آللی از یک نسل به نسل دیگر (بوسیله گزینش یا مهاجرت) تغییر نخواهد کرد؛ ولی تحت تأثیر عاملی به نام شانس، فراوانی آللی میتواند تفاوتهایی را بین نسلهای مختلف نشان دهد. در شرایط طبیعی برخلاف پیشبینیهای آماری، تعداد گامتهای تولیدی توسط افراد با ژنوتیپهای مختلف، متفاوت خواهد بود و احتمال ترکیب تصادفی برای همه گامتها نیز وجود ندارد. بنابراین در هر نسلی انحرافاتی از موازنه هاردی- واینبرگ دیده میشود که به این تغییرات زیستی رانش ژنتیکی تصادفی18 نیز گفته میشود. واریانس فراوانی آللی با استفاده از رابطه زیر محاسبه میشود:

واريانس فراواني آلل = p (1-p) / 2Ne

p فراواني آلل و Ne اندازه جمعيت موثر است. اندازه مؤثر جمعیت به افرادی از جمعیت گفته می‌شود که از نظر ژنتیکی بر نسل بعدی تأثیرگذار هستند. به عبارت دیگر افرادی از جمعیت که نابالغ یا آنقدر پیر هستند که قادر به تولید مثل نیستند و یا افرادی که گامتهای غیر طبیعی تولید مینمایند، جزء جمعیت مؤثر محسوب نمیگردند. این افراد ممکن است دارای گامتهای غیرقابل بارور بوده و یا به دلیل زیست در مناطق جغرافیایی متفاوت و یا اختلاف در زمان تخمریزی، امکان آمیزش آنها با سایر افراد جمعیت وجود ندارد. اندازه جمعیت مؤثر باعث کاهش واریانس فراوانی آللی و اندازه کوچک جمعیت مؤثر باعث افزایش واریانس فراوانی آللی میشود. به عبارت دیگر در جمعیتهای کوچک نوسانات طبیعی در فراوانی آللی از نسلی به نسل دیگر بسیار شدیدتر است (کیوانشکوه و درافشان، 1389).
15-1- موازنه هاردي- واينبرگ و دلایل انحراف از آن
براساس مدل هاردی- واینبرگ، جمعیتی از یک موجود دیپلوئید با تولید مثل جنسی که در یک جایگاه دارای آللهای A با فراوانی p و B با فراوانی q باشند، با فرض آمیزش تصادفی میان افراد، پس از یک نسل فراوانیهای ژنوتیپهای AA، AB و BB به ترتیب برابر با P2، pq2 و q2 خواهد بود. این مدل را میتوان در مواردی که بیش از دو آلل وجود دارد نیز تعمیم داد. در این مدل فراوانی هر ژنوتیپ هموزایگوت دو برابر حاصل ضرب فراوانیهای دو آلل است. برای تعیین مطابقت آماری مجموعهای از دادهها با مدل هاردی- واینبرگ میتوان از آزمون کای مربع استفاده نمود. موازنه هاردی- واینبرگ بر پایه یک سری از فرضیهها استوار است که گرچه این فرضها دقیق و سخت‌گیرانه بهنظر میرسد اما جمعیتهای بزرگ که برون آمیزی دارند از این موازنه پیروی میکنند چرا که اثر جهش و گزینش در آنها اندک است. اگر ما بتوانیم فراوانی هر یک از آللها را بهدست آوریم میتوانیم فراوانی حضور ژنوتیپها را نیز در جمعیت پیشبینی کنیم.
هنگامی که یک جمعیت از موازنه پیروی نمیکند محققان سعی میکنند تا بفهمند چرا این گونه است. چراکه عدم پیروی از این موازنه میتواند نکات جالبی را در مورد ماهیت لوکوس مورد مطالعه (مثلا اثر انتخاب طبیعی) و یا جمعیت مورد مطالعه (مثلا درون آمیزی) به ما نشان دهد. بنابراین باید مظمعن شویم که نتایج حاصل بهدلیل خطای انسانی نیست. بهعنوان مثال نمونهبرداری نامناسب از جمعیت میتواند منجر به عدم تطابق با موازنه مذکور شود. حالت ایده آل اندازه یک نمونه حداقل 30 تا 40 فرد از یک جمعیت است. در ذیل مهمترین عوامل ایجاد انحراف از تعادل آورده شده است:
1- گزینش: میزان مرگ و میر متفاوت افرادی که دارای یک ژنوتیپ و یا یک نوع آلل خاص بوده و یا این که دارای یک نوع گامت خاص هستند، در گزینش آنها دخالت خواهد داشت. بسته به این که چه ژنوتیپ یا ژنوتیپهایی شایستهترین حالات ممکن هستند، انواع مختلف گزینش شامل غالبیت (Dominance)، فوق غالبیت (Over-dominance)، نیمه غالبیت (Semi-dominance) و تحت غالبیت (Under-dominance) بروز میکند.
2- آمیزش غیر تصادفی: این مورد میتواند به صورتهای مختلفی روی دهد؛
– درون آميزي (Inbreeding): آمیزش میان خویشاوندان را درون آمیزی مینامند که میتواند نتیجه عدم پراکنش مناسب افراد باشد. درون آمیزی سبب افزایش افراد خالص و کاهش افراد ناخالص می‌شود.
– آمیزش همسان پسندانه (Assortive mating): به حالتی اطلاق میشود که در آن احتمال آمیزش بین افرادی که ژنوتیپ یا فنوتیپ یکسان دارند، بیشتر است.
– آمیزش ناهمسان پسندانه (Disassortive mating): در این روش، احتمال آمیزش بین افراد ناهمسان بیشتر از افراد همسان است.
3- مهاجرت: مهاجرت گروهی از افراد جمعیت به درون جمعیت دیگر که دارای فراوانی آللی متفاوت بوده و به واسطه عوامل جغرافیایی یا متفاوت بودن زمان تخم ریزی از هم جدا شدهاند، منجر به انحراف از حالت تعادل هاردی- واینبرگ میشود. این حالت اثر Wahlund نامیده میشود که موجب افزایش تعداد افراد خالص میگردد.
4- آللهای پوچ (Null alleles): آللهای پوچ در واقع منجر به انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ نمیشوند، اما میتوانند این تصور را ایجاد نمایند که تعادل برقرار نبوده و انحراف وجود دارد. هنگامی که بنا به دلایلی یک آلل همبارز مشاهده نمیشود، به آن آلل پوچ میگویند. عدم تظاهر یک آلل در هنگام تعیین ژنوتیپها منجر به بروز اشتباه خواهد شد، زیراکه ژنوتیپهای ناخالص میان یک آلل قابل رؤیت و یک آلل پوچ به عنوان ژنوتیپ خالص محسوب میشوند. این موضوع منجر به افزایش تعداد افراد خالص و انحراف از مدل هاردی- واینبرگ خواهد شد. آللهای پوچ در ریزماهوارهها در نتیجه وقوع جهش در یکی از نقاط آغازگر و عدم تولید محصول PCR پدید میآیند (رضایی و همکاران، 2011).
16-1- آماره F
شاید بتوان گفت که متداولترین روش برای کمی کردن تفاوتهای ژنتیکی بین جمعیتها بر پایه استفاده از متغیرهای آماری F استوار است که در سال 1951 توسط رایت19 ابداع شد. متغیرهای آماری 20F از ضریب درون آمیزی برای محاسبه تفاوتهای ژنتیکی و بررسی چگونگی تقسیم این تنوع ژنتیکی بین گروهها در سه سطح مختلف استفاده میکنند. ترتیب ارایه این پارامترها در اینجا براساس روش متداول در منابعی است که زیربنای تئوری متغیرهای F را پدید آوردهاند. اولین متغیر آماری FIS است (I21 بیانگر افراد و S22 بیانگر زیرجمعیت است) که میزان درون آمیزی بین افراد خویشاوند را نسبت به سایر افراد جمعیت محاسبه میکند. در حقیقت این پارامتر احتمال این که دو آلل در یک فرد آللهایی متمایز باشند که از یک جد مشترک مشتق شدهاند را اندازه میگیرد که همانند ضریب درون‌آمیزی (F) است. FIS را توسط رابطه زیر بهدست میآوریم:
FIS= HS – HL/HS

در این معادله HL عبارت از هتروزیگوسیتی مشاهده شده در یک زیرجمعیت در زمان مطالعه (هتروزیگوسیتی افراد) و HS میزان هتروزیگوسیتی مورد انتظار (هتروزیگوسیتی زیرجمعیت) است در شرایطی که دادهها از موازنه هاردی- واینبرگ پیروی میکنند.
دومین متغیر آماری F که تحت عنوان شاخص تثبیت نیز شناخته میشود FST (T23 بیانگر کل جمعیت است) است. با استفاده از این شاخص میزان تفاوتهای ژنتیکی بین زیرجمعیتها را برآورد میکنند. در حقیقت این شاخص میزان درونآمیزی یک زیرجمعیت را در مقایسه با کل جمعیت (شامل همه زیرجمعیتها) میسنجد و احتمال این که دو آلل برحسب تصادف از داخل یک جمعیت خارج شده و هر دو شاخص تبارشناختی آن باشند را نشان میدهد. FST را بهصورت زیر محاسبه میکنیم:

FST= HT -HS /HT
HS در این معادله مقدار هتروزیگوسیتی زیرجمعیت و HT مقدار قابل پیشبینی هتروزیگوسیتی کل جمعیت است. FIT سومین متغیر آماری F است که برآوردی کلی از میزان درونآمیزی در یک جمعیت را با محاسبه هتروزیگوسیتی افراد نسبت به کل جمعیت بهدست میآورد. بنابراین عدم وجود تولید مثل تصادفی در جمعیت و همچنین تقسیم شدگی جمعیت به زیرجمعیتها بر مقدار FIT تأثیر می‌گذارد. محاسبه FIT به شکل زیر است:
FIT= HT – HI/HT
رابطه سه متغیر بیان شده بهصورت زیر میباشد:
FIT= FIS + FST – (FIS)(FST)
17-1- فاصله ژنتیکی24 (Nei, 1978)
یک راه محاسبه شباهت ژنتیکی دو جمعیت برآورد فاصله ژنتیکی بین آنهاست. راههای متعددی برای اندازهگیری فاصله ژنتیکی وجود دارد که یکی از متداولترین آنها فرمول نئی است که تحت عنوان فاصه ژنتیکی استاندارد (D) نامیده میشود. برای محاسبه آن ابتدا باید پارامتر شباهت ژنتیکی (I) که آن نیز توسط نئی ارایه شده است را بشناسیم (نئی، 1978). این پارامتر در حقیقت شباهتهای ژنتیکی جمعیتها را نشان میدهد. برای یک لوکوس مشخص، I را به طریق زیر بهدست آوریم:
I=(∑_(i=1)^m▒〖(P_ix P_iy)〗)/√([(∑_(i=1)^m▒〖p_(〖ix〗^2 )) (∑_(i=1)^m▒p_(〖iy〗^2)]) 〗)
در این معادله P_ix عبارت است از فراوانی آلل i در جمعیت x، P_iy عبارت است از فراوانی آلل i در جمعیت y و m تعداد آللها در هر لوکوس. مقدار I بین صفر و یک متغیر است و هنگامی که آن را محاسبه کردیم میتوانیم فاصله ژنتیکی را با استفاده از رابطه زیر بهدست آوریم:

D= -LnI
مقدار D بین صفر و بینهایت متغیر است. اگر دو جمعیت دارای فراوانی آللی مشابهی باشند، مقدار شباهت ژنتیکی بین دو جمعیت به 1 نزدیک شده و فاصله ژنتیکی به صفر نزدیک میشود. در مقابل اگر دو جمعیت در هیچ آللی مشترک نباشند، I معادل صفر و D بینهایت خواهد بود.
18-1- ضرورت تحقیق
در طی 20 سال گذشته زیست شناسی مولکولی تحولی شگرف در تحقیقات بومشناسی پدید آورده است. در طول این مدت استفاده از روشهای مولکولی برای شناسایی ژنتیکی موجودات، جمعیتها و گونهها در آزمایشگاهها متداول گشته و توانسته است اطلاعات جدید و فراوانی را در زمینه بوم شناسی و تکامل گیاهان، جانوران، باکتریها، جلبکها و قارچها فراهم آورد. بوم شناسی شاخهای از زیست شناسی است که به مطالعه روابط بین گونهها و برهم کنش آنها با محیط فیزیکی پیرامونشان میپردازد. فعالیتهای بوم شناسی بهخصوص در سطح مولکولی کمک شایانی به پایش ذخایر ماهیان میکند و با توجه به خروجیهای حاصل از اطلاعلات آن میتوان تصویر روشنی از شرایط کنونی و آینده ذخایر ماهیان متصور شد. تنوع ژنتیکی منابع دریایی اهمیت حیاتی برای مدیریت و حفاظت از آنها داشته و به عنوان اولین پیشنیاز برای حفظ سازگاری جمعیتها در شرایط محیطی در حال تغییر محسوب میگردد (دیز و پرسا، 2009). حفظ تنوع ژنتیکی گونههای دریایی نقش بسیار مهمی در پایداری و بقای اکوسیستم با اهمیت دریای خزر دارد. اکثر مطالعات در دریای خزر بر روی گونههای صرفاً اقتصادی مثل ماهی سفید، کلمه و کپور انجام پذیرفته است. شگماهی براشنیکووی از راسته شگ ماهیان از جمله ماهیانی است که به فراوانی در آبهای جنوبی دریای خزر پراکنش یافته و اثر غیرقابل انکاری بر هرم اکولوژیکی دریای خزر دارد. علیرغم فراوانی و پراکنش گسترده شگ‌ماهیان در دریای خزر تاکنون هیچ مطالعهای بر وی ژنتیک جمعیت ذخایر شگماهیان این دریا صورت نگرفته و اطلاعات اکولوژیکی در مورد آنها محدود است. با توجه به اینکه شگماهیان بخاطر رژیم غذایی پلانکتونخواری در سطوح اولیه هرم اکولوژیکی و زنجیره غذایی قرار میگیرند، لذا حفظ این ماهیان در سلامت اکوسیستم دریای خزر مطمئنا” میتواند اثرات قابل توجهی داشته باشد. از اینرو با توجه به موارد ذکر شده، این ضرورت احساس شد تا از وضعیت ساختار جمعیتی گونه A. braschnikowi بهعنوان یکی از گونههای بومی راسته شگماهی شکلان در دریای خزر اطلاعاتی در دسترس قرار گیرد. بی شک این تحقیق زمینهساز مطالعات متعدد دیگری بر روی دیگر گونهها و جنسهای شگماهیان دریای خزر خواهد شد.
19-1- اهداف
با توجه به موارد ذکر شده تحقیق حاضر با هدف پاسخ به سؤالات زیر صورت پذیرفت:
1- آیا نشانگرهای ریزماهواره مورد استفاده در این پژوهش از توانایی و کاربرد لازم جهت شناسایی آللها و نشان دادن میزان تنوع ژنتیکی شگماهی براشنیکووی برخوردارند؟
2- تنوع ژنتیکی شگماهی خزری در سواحل جنوبی دریای خزر چگونه است؟ آیا مناطق مورد بررسی از نظر ژنتیکی از یکدیگر متمایز هستند یا همپوشانی از خود نشان میدهند؟ آیا شباهتها یا فاصلههای ژنتیکی متأثر از فواصل جغرافیایی بین مناطق نمونهبرداری میباشند؟
20-1- فرضیهها
1- نشانگرهای مورد استفاده در تحقیق حاضر کارایی لازم را برای جداسازی و تشخیص جمعیتهای احتمالی از شگماهی براشنیکووی در دریای خزر دارند.
2- شگماهی براشنیکووی (A. braschnikowi) در دریای خزر از تنوع آللی و ژنتیکی مناسبی برخوردار است ولی بین مناطق مورد بررسی تمایز اندکی وجود دارد.
فصل دوم
پيشينه تحقيق
1-2- مروری بر مطالعات انجام شده در داخل کشور
خـارا (1383) با استفـاده از روش PCR-RFLP روی قطعـه‌ای از ژنـوم میتوکنـدریایی به طـول bp3500 شـامـل tRNA-glu، tRNA-lu، N/D 5/6 و Cyt b توانست ماهی سیم دریای خزر (Abramis brama) را از ماهی سیم دریاچه سد ارس جدا کند. نتایج نشان دادند که ماهی سیم دریای خزر دارای تنوع بیشتری نسبت به ماهی



قیمت: تومان

دسته بندی : مقاله و پایان نامه

دیدگاهتان را بنویسید