فصل اول
مقدمه
فصل اول:
مقدمه و کلیات
1-1 مقدمه
تنوع زیستی اساس زندگی بر روی زمین است. کاهش تنوع گونههای زراعی و جانوری، یک تهدید جدی برای امنیت غذایی است. منابع ژنتیکی اموال عمومی هستند که حفاظت از آنها به معنای خدمت به مردم میباشد. حفاظت از منابع ژنتیکی در کشاورزی مانند بیمه کردن محصولات کشاورزی در برابر تغییرات احتمالی (بیماری جدید و آفات) میباشد. حفاظت از منابع ژنتیکی برای ایمنی مواد غذایی و حصول اطمینان از کیفیت محصولات غذایی و همچنین سازگاری با تغییرات محیطی از قبیل تغییرات آب و هوا و مقاومت در برابر بیماری مهم است (عثمان1 و همکاران، 2011).
کشور ایران در پهنهی گستردهی خود به واسطه وجود سه رشته کوه اصلی البرز در شمال، زاگرس در غرب و کوههای فلات در مرکز، دارای آب و هوای متنوع و در نتیجه دارای عوامل محیطی گوناگونی میباشد. عوامل محیطی مختلف موجب تشکیل انواع زیستگاهها و تنوع حیوانات در مناطق مختلف ایران شده است. در اثر تأثیرات زیستگاههای مختلف، انواع نژادها از یک گونهی حیوانی به وجود آمدهاند. در میان انواع حیوانات گوناگون این سرزمین پهناور، پرندگان، دارای تنوع قابل توجهی میباشند (توکلیان، 1378). اکثر نژادهای مرغان بومی کشور از دسته مرغان آسیایی و نژادهای شرقی هستند. با تأکید بر این نکته که نژادهای بومی در هر کشور به عنوان یک سرمایه ملی محسوب میشوند، بنابراین حفظ این نژادها همراه با برنامهریزی برای افزایش تولید و سودآوری آنها امری بسیار ضروری میباشد (قربانی و همکاران، 1386(.
مناسبترین خاستگاه محیطی پرورش گروههای نژادی مرغهای بومی ایران، روستاها میباشند. در شرایط کنونی، روستائیان به نژادهای مقاوم با تولید مطلوب و منطبق با شرایط اقلیمی مختلف، نیاز دارند (توکلیان، 1378). بهبود دامهای اهلی برای اصلاح نژاد از طریق انتخاب دامهای دارای فنوتیپ برتر تمرکز یافته است. با وجود پیشرفتهای اخیر در زمینههایی مانند توسعه تکنیکهای توالی یابی ژنوم، شناسایی و کشف انواع نشانگرهای ژنتیکی، ارائه نقشههای ژنتیکی متراکم از گونههای مختلف حیوانات اهلی و توسعه روشهای آماری و کامپیوتری، میتوان از آنها به عنوان ابزاری قدرتمند جهت مطالعه ژنتیکی موجودات زنده بالاًخص گونههای اهلی، استفاده نمود (ویلیامز2، 2005). امروزه با استفاده از نشانگرهای مولکولی میتوان ژنهایی که صفات مهم اقتصادی را کد میکنند، شناسایی و مطالعه نمود (مونتالدو و مزاهررا3، 1998). همچنین ضمن تعیین ژنوتیپ افراد در اکثر جایگاههای ژنی، میتوان اطلاعاتی را در خصوص فراوانی آللی ژنهای مطلوب کسب نمود و از آن در جهت انتخاب دامهای برتر یاری جست (بایس4 و همکاران، 2005).
در نگهداری و پرورش مرغ تخمگذار هدف تولید تخم بالا و جلوگیری از کرچی میباشد. اخیراً با توسعه ژنتیک مولکولی روشهای بیولوژیکی اساس ژنتیکی کرچی به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است. کرچی یک صفت چندژنی5 است که حداقل توسط دو ژن غیرجنسی غالب کنترل میشود. پرولاکتین نقش حیاتی برای شروع و ادامه کرچی ایفا میکند. برخی از عوامل دیگر، مثل دوپامین نقش بازدارنده بر ترشح پرولاکتین دارد (زوا6 و همکاران، 2010(.
دوپامین از طریق سیستم باب هیپوفیزی به وسیله چند عصب هیپو تالاموسی به هیپوفیز میرسد که به وسیلهی خود پرولاکتین، استروژنها و چند نوروپپتید و نوروترنسمیترها تنظیم میشود. دوپامین با گیرندههای نوع دوم دوپامین متصل میشود که این گیرندهها به کانالهای غشایی و پروتئینهای G متصل هستند. فعالیت ترشحی سلولهای لاکتوتروپ هیپوفیز را مهار میکند (بن جاناتان و ناسکو7 ، 2001). دوپامین، انتقال دهنده عصبی در سیستم عصبی مرکزی به مقدار فراوانی ترشح میشود و نقش مهمی در شناخت، احساسات و فعالیت غدد درونریز در پستانداران دارد و مسئول فعالیت GnRH است و نقش مهارکنندهگی و تحریک کنندهگی در آزاد شدن گنادوتروپینها دارد (زوا و همکاران، 2011).
تاکنون، دست کم پنج گیرنده مجزا از دوپامین شناسایی شده که شامل DRD1- DRD5 است و به دو دسته کلاسه بندی میشوند، مانند D1 (DRD1 و DRD5) و D2 (DRD2، DRD3 و DRD4). گیرندهها بر اساس فارماکولوژی آنها، تفاوتهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی دارند (زوا8 و همکاران، 2010).
1-2 فرضیهها
H0: چندشکلی درگیرنده یک ژن دوپامین درجمعیت مرغان بومی خوزستان وجود دارد.
H1: چندشکلی در گیرندهی یک ژن دوپامین درجمعیت مرغان بومی خوزستان وجود ندارد.
1-3 اهداف تحقیق
1-3-1 اهداف اصلي:
الف) تعیین چندشکلی ژن دوپامین در مرغ بومی خوزستان
ب) تعیین فراوانی آللهای گیرنده یک ژن دوپامین در نمونه های مورد مطالعه
ج) تعیین فراوانی ژنوتیپی گیرنده یک ژن دوپامین
1-3-2 اهداف فرعي:
الف) بررسی تعادل هاردی واینبرگ در مورد ژن دوپامین در جمعیت مرغان بومی خوزستان
ب) بررسی تنوع ژنتیکی مرغ بومی
1-4 نوآوري:
تا کنون گزارش مکتوبی در زمینه پلی مورفیسم دوپامین در مرغ بومی خوزستان یافت نشده است
فصل دوم
کليات و مروري بر پژوهشهاي انجام شده
فصل دوم
کليات و مروري بر پژوهشهاي انجام شده
2-1 مقدمه
طیور در حال حاضر بزرگترین گونههای جانوری در سرتاسر جهان هستند (فائو9، 2000). گوشت مرغ و تخم مرغ نه تنها پروتئین با کیفیت بالا را تاٌمین مینمایند بلکه ویتامینها و مواد معدنی را نیز فراهم میکنند. افزایش مصرف سالیانه تخم مرغ در کشورهای در حال توسعه بین سالهای 2005 تا 20015، 26 درصد بوده است درحالیکه در کشورهای توسعه یافته 4/2 درصد بوده است. بنابراین تخم مرغ میتواند یک جایگزین خوب غذایی برای مردم کشورهای فقیر باشد. از آنجایی که قیمت تخم مرغ نسبت به مرغ ارزانتر میباشد میتوان با بهبود ارزش تغذیهای تخم مرغ آن را به یک غذای کاربردی برای مردم فقیر فراهم نمود (فارل10، 2013).
2-2 طبقهبندی مرغ از نظر جانور شناسی
حیوانات به چند شاخه بزرگ تقسیم میشوند یکی از آنها شاخه مهرهداران11 است. این شاخه دارای ردههای متعددی است که رده اوس12 یا پرندگان یکی از آنها است. زیر راسته آن موسوم به گالی13 است که تیره سیخکداران یا فازیانینده14 جزو آن است. در تیره سیخکداران زیر تیره تولک روندگان یا فاسیالینه15 قرار گرفتهاند که شامل جنس گالوس16 دومستیکوس17 یا مرغ خانگی قرار گرفته است (زهری، 1388). گفته میشود که همه نژادهای مرغ از چهار نوع وحشی زیر حاصل شدهاند:
1- گالوس- گالوس مثل مرغ جنگلی قرمز
2- گالوس- لافایتی مثل مرغ جنگلی سیلان
3- گالوس- سورناتی مثل مرغ جنگلی خاکستری
4- گالوس- واریوس مثل مرغ جنگلی آبی و سبز
هر چهار گونه در مناطق آسیای شرقی یافت میشوند. طی هزاران سال انواع وحشی مرغ با هم آمیخته شده و یا توسط انسان آمیزش داده شدهاند که منجر به پیدایش نژادهای فعلی گردیده است. مرغ جنگلی قرمز یا گالوس گالوس بیشترین گسترش را در بین گونههای وحشی دارد و شاید جد اصلی مرغهای مدرن امروزی باشد. بیولوژی طیور اهلی، ارتباط نزدیکی با بیولوژی پرندگان دیگر دارد و اگرچه طیور حداقل 2000 سال قبل از میلاد مسیح اهلی شدهاند و از نظر اندازه و طرحهای رنگی و سازش با محیط و قدرت تخمگذاری، مطالعات زیادی در طول تاریخ اهلی شدن آن، به عمل آمده است اما هنوز هم شباهت زیادی به اجداد وحشی خود دارند (اوحدی نیا، 1370).
2-3 ضرورت توسعه مرغداري
طیور دارای یک فاصله نسلی کوتاه و میزان بالای تولید هستند. همچنین میتوان آنها را به راحتی به مناطق مختلف منتقل کرد و نسبتاً ارزان قیمت هستند. مصرف آنها در مقایسه با دیگر حیوانات مزرعه مانند گاو و نشخوارکنندگان کوچک راحتتر میباشد و نیازی به یخچال برای نگهداری اضافهی گوشت آن نیست (فارل، 2013).
2-3-1 افزایش جمعيت
از اوایل قرن بیستم جمعیت جهان روندی رو به افزایش داشته و تامین نیازهای خوراکی بخصوص پروتئین حیوانی از چالشهای اساسی در کشورهای در حال توسعه میباشد )محمدی پسته بیگ، 1390). امروزه یکی از بزرگترین دغدغهها از لحاظ سیاستگذران و برنامه ریزان، تامین نیازهای جامعه است تا سطح رفاه نسبی افراد جامعه را افزایش دهند )پشمی و مرادی، 1392). طبق گزارش بخش مطالعات جمعیت در فرهنگستان علوم جمهوری اسلامی ایران در طی 13 سال آینده با روند فعلی بهطور خوشبینانه رقمی در حدود 4 2میلیون نفر افزایش جمعیت خواهیم داشت که باید علاوه بر تامین غذا و پروتئین حیوانی برای جمعیت فعلی برای 24 میلیون نفر جمعیت اضافی نیز غذا تولید شود )زهری، 1388).
2-3-2 پایين بودن مصرف سرانه پروتئين حيوانی و توليدات طيور
مواذ غذایی پروتئینی در تغذیه انسان از اهمیت زیادی برخوردار است و در این میان صنعت مرغداری به عنوان فراهم کننده مواد غذایی پروتئینی از شرایط و جایگاه ممتازی برخوردار میباشد. بالا رفتن درآمد سرانه، قدرت خرید مردم بهخصوص مواد غذایی را افزایش داده و در نتیجه مصرف مواد پروتئینی نیز افزایش یافته است )پشمی و مرادی، 1392). به همین دلایل کمبود و کاهش انواع پروتئین حیوانی در آینده پیش بینی میشود. از طرفی مصرف سرانه گوشت مرغ و تخممرغ در ایران کمتر از مصرف سرانه بسیاری از کشورهای دیگر است )زهری، 1388).
2-3-3 کاهش تولید و مصرف گوشت قرمز
تولید گوشت قرمز در ایران و کشورهای جهان سوم بر اساس مراتع طبیعی بنیان گذاشته شده است. در حال حاضر 123 میلیون واحد دامی در کشور وجود دارد که 83 میلیون واحد دامی از مراتع کشور تعلیف میشوند، در حالی که ظرفیت مراتع کشور در حدود 37 میلیون راس دام است. این امر سبب شده که به سرعت مراتع بیشتری به صورت مخروبه در آمده و غیر قابل چرا و استفاده شود و در مصرف و تولید گوشت قرمز تاثیر گذارد، به طوری که سالیان دراز کشور متکی به واردات عظیم گوشت قرمز گشته است. مصرف سرانه گوشت قرمز در ایران به علل کمبود، گرانی و کاهش قدرت خرید مردم به نحو چشمگیری کاهش یافته است (زهری، 1388).
2-3-4 سهولت تهيه توليدات طيور و ارزش بالاي آن از نظر تغذیه انسان
دو مزیت سبب شده است که تولیدات طیور با ارزشتر از سایر منابع پروتئینی باشد.
2-3-4-1 مزایای تغذیهای و بهداشتی
گوشت مرغ از نظر میزان پروتئین و همچنین کم بودن چربی، ضریب هضم بالا، پایین بودن کلسترول و اسیدهای چرب اشباع شده، کم بودن افت کشتار دارای ارزش بیشتری نسبت به گوشت قرمز و حتی ماهی میباشد. تخممرغ ازنظر انرژی و پروتئین و داشتن ویتامینهای ضروری برای انسان یک غذای کاملاً مطلوب به شمار میرود.
2-3-4-2 مزایای اقتصادی
رشد سریع جوجههای گوشتی، تولید تعداد زیاد تخممرغ در نژادهای تخمگذار، ضریب تبدیل غذایی پایین در تولید گوشت و تخممرغ، سهولت تغذیه از منابع اولیه غیر قابل مصرف برای انسان ، برگشت سریع سرمایه، ارزان تمام شدن چشمگیر تولیدات طیور نسبت به سایر منابع پروتئینی، سرعت و سهولت و تنوع در آماده کردن و پخت گوشت مرغ از مزایای اقتصادی آن میباشد )زهری، 1388).
2-4 تاریخچه پرورش مرغ بومی در ایران
در ایران باستان بالاخص در زمان زرتشت، اقتصاد تعدادی از شهرهای ایران بر پایه پرورش طیور استوار بود. با استناد به شواهد و مدارک موجود، از زمان ورود مرغهای نیمه وحشی به ایران تا کنون ایرانیان در جهت پرورش و اصلاح نژاد طیور زحمات فراوانی را متحمل شده و به موفقیتهایی نیز رسیدهاند. هر چند عوامل بازدارنده بسیاری بر سر راه روستائیان در جهت اصلاح هر چه مطلوبتر مرغ بومی از زمانهای پیشین تا کنون وجود داشته است. اصلاح نژاد تجربی، قبل از به وجود آمدن علم ژنتیک و یا اصلاح نژاد متکی بر اصول و قواعد ژنتیکی، توسط روستائیان انجام میگرفته است.
2-5 نژاد چیست؟
نژاد حاصل تفکیک و جداسازی در داخل یک گونه حیوانی است که بخشی از صفات و خصوصیات خود را به نسل بعد منتقل میکند. این صفات نژادی ناشی از انتخاب به وسیله انسان و یا سازگاری با محیط است. این صفات )رنگ پر یا پوست و شکل تاج( ممکن است قابل مشاهده باشند یا در ظاهر )مقاومت و سرعت رشد، مصرف غذا، تولید تخممرغ و غیره) دیده نشوند )زهری، 1388).
2-5-1 نژادهای بومی مرغ در ایران
نژادهای مرغ موجود در ایران به سه گروه تقسیم میشوند، که عبارتند از:
-1 نژادهای خالص ایرانی
-2نژادهای خارجی که از سال 1333 به ایران وارد شدهاند و بعضی از آنها به صورت بومی در آمدهاند.
3- مرغهای آمیخته که نمیتوان آنها را در دسته نژاد معینی طبقهبندی کرد )زهری، 1388).
نژادهای خالص مرغان بومی در ایران دو دستهاند:
الف- مرغان تخمگذار مانند. مرغ زرده کرک، مرندی، حماری، دشتیاری
ب- مرغان گوشتی مانند: مرغ لاری )مخاوات و محب الحجه، 1381).
در شکل 2-1 تصاویر نژادهای مرندی و لاری نشان داده شده است.
مرغ و خروس نژاد لاری
مرغ و خروس نژاد مرندی
شکل 2-1 مرغان بومی ایران
2-6 خصوصيات مهم مرغان بومی
طیور بومی در حدود 80 درصد از گلههای بومی را در آفریقا و آسیا تشکیل میدهند. مرغان بومی پتانسیل بالایی برای تنظیم مسئله کمبود پروتئین مصرفی در مقایسه با بیشتر گونههای حیوانی دیگر دارند که ناشی از فاصله نسل کوتاه و توانایی آنها برای زنده ماندن در شرایط محیطی سخت میباشد. مرغان بومی با شرایط روستاها سازگاری پیدا کرده و نسبت به بیماریهای منطقهای مقاوم هستند، از نظر غذا قانعند و غذای آنها از ضایعات کشاورزی، مازاد غذای روستائیان و پسچر غلات میباشد. مرغان بومی معمولاً کوچک، اما فعال هستند )لاگونا18، 2008). عیب طیور بومی در مقایسه با گونههای امروزی این است که، طیور بومی عموماً تولیدکنندگان ضعیف گوشت و تخممرغ محسوب میشوند، در بسیاری از کشورهای توسعه یافته، طیور بومی به وسیله سویههای تجاری جایگزین شدند. در برخی از کشورها این روش برای افزایش بهره دهی تحت سامانههای روستایی برای دهههای متمادی دنبال شد، اما در بهبود قابلیت سازگاری ناموفق بود )تکلولد19 و همکاران، 2006). با نگاهی به گذشته به خوبی میتوان دریافت که مرغ بومی شایستگی خود را بهخوبی ثابت نموده است. حفظ نژادهای مرغ در ایران و برنامهریزی جهت افزایش تولید و سودآوری آنها امری بسیار ضروری است.
2-6-1مرغ بومی خوزستان
با توجه به شرایط آب و هوایی که استان خوزستان دارد مرغ بومی آن حائز اهمیت میباشد. برخی از خصوصیات
مرغ ، مرکز مرغ بومی استان خوزستان (شرکت نهادههای دامی جاهد- مرکز تولید مواد ژنتیکی دام):
منشاء این مرغها از استانهای فارس و کهگیلویه و بویر احمد میباشد. شامل 5000 قطعه مرغ و 600 قطعه خروس میباشد. میانگین تولید تخم مرغ به ازای هر مرغ حدوداً 160 تخم در سال میباشد. طول دورهی کرچی در این جمعیت حدوداً 12 روز است.
2-7 خون مرغ
گلبولهای قرمز پرندگان به دلیل هسته دار بودن، از پستانداران، متمایز بوده و از نظر اندازه نیز آنها بزگتر هستند. گلبولهای قرمز پرندگان، بیضی شکل و هسته دار است. نیمه عمر گلبول قرمز در پرندگان کوتاه و حدود 45-28 روز میباشد (جونز20، 2015).
2-8 جایگاه کروموزومی
در زمینههای ژنتیک و محاسبات ژنتیکی، یک جایگاه کروموزومی (لوکوس)، قسمتی خاص از یک ژن یا توالی دی. اِن. اِی در کروموزوم است. کروموزومهایی که دارای آللهای مختلف از یک ژن خاص در یک مکان هستند، هتروزیگوت در حالی که کروموزومهایی که دارای آللهای مشابه هستند هموزیگوت نامیده میشوند. مواد توارثی مرغ بر روی 39 جفت کروموزوم واقع شده است. کروموزومها در داخل هسته سلول قرار دارند و حاوی واحدهای توارثی میباشند (لی نور21 و همکاران، 2009).
2-9 توارث تخممرغ
تولید تخممرغ مثل سایر صفات تحت تاثیر عوامل محیطی و ژنتیکی است. وراثتپذیری میزان تولید تخممرغ متوسط تا پایین گزارش شده و تعداد ژنهایی که در تخمگذاری مؤثرند فراوان بوده ولی تخممرغهائی که در طول سال توسط یک مرغ تولید میشود به عوامل محیطی مانند تغذیه، نور، دما و مدیریت بستگی دارد. به همین دلیل اصلاح کنندگان رکوردهای خانوادگی را برای بهگزینی این صفت به کار میبرند. میزان وراثتپذیری تولید تخممرغ به صورت مرغ روز معمولاً کمتر از مقدار آن برای تولید تخم به صورت مرغ- لانه و مرغ زنده است (مینگ22 و همکاران، 2003).
2-10 میزان تخمگذاری
هر چرخه تخمگذاری 12 ماه میباشد. تولید تخم مرغ وقتی به سن 22-18 هفتگی میرسند بسته به نژاد و فصل آغاز میشود (جاکوب23 و همکاران، 2011). سرعت تخمگذاری به طول سیکل و توقف کوتاه بستگی دارد. هرچه طول سیکل بیشتر و تعداد روزهایی که مرغ تخم نمیگذارد کمتر باشد سرعت تخمگذاری و در نتیجه تعداد تخممرغهائی که در سال گذشته میشود بیشتر است )مینت24 و همکاران، 2010). با افزایش سن مرغ تعداد تخم مرغها کمتر میشود ولی اندازه آنها بزرگتر میشود. )جانیر25 و همکاران، 1987).
2-11 کرچی
کرچی یک پدیده فیزیولوژیکی طبیعی است که در طیور ظاهر میشود. در مدت کرچی مرغ روی تخم مرغها میخوابد و آنها را به جوجه تبدیل میکند و در این مدت تخمگذاری مرغ متوقف میشود. بعضی از نژادها و یا سویهها ممکن است در سال چندین بار کرچ شوند و تعدادی نیز آن را به ندرت و یا اصلاً نشان ندهند. از لحاظ فیزیولوژیکی در زمان کرچی ترشح هورمون پرولاکتین افزایش پیدا میکند. اگر به یک مرغ هورمون پرولاکتین تزریق شود کرچ میشود.
از لحاظ ژنتیکی دو جفت ژن (Aa و Cc) بدنی باعث کرچی میشوند و در موقعی که دو جفت ژن به صورت غالب وجود داشته باشند مرغ از خود کرچی نشان میدهد. علاوه بر عوامل ژنتیکی برای بروز کرچی پارهای عوامل محیطی نیز مؤثر هستند و باعث تسریع در بروز آن میشوند. مثلاً تاریک شدن محیط، جمع شدن تخم مرغ در آشیانه و بالا رفتن حرارت محیط باعث بروز کرچی میگردند. اگر مرغی در سال چندین بار از خود کرچی نشان دهد، تخمگذاری سالیانه آن مرغ کم خواهد شد لذا با انتخاب و به نژادی میتوان به آسانی ژنهای عامل این صفت را حذف نمود (توکلیان، 1378).
2-12 بهبود جوامع حیوانی
هدف از اصلاح دام، بهبود ژنتیکی یک حیوان نیست بلکه هدف، بهبود جوامع حیوانی به منظور بهبود نسلهای بعدی است. برای این هدف متخصصین اصلاح دام دو موضوع مهم انتخاب و آمیزش را مطرح کردهاند که هر دو نیاز به تصمیمگیری دارد. اولین ابزار برای ایجاد تغییر ژنتیکی توسط متخصصین اصلاح دام، انتخاب و دومین ابزار آمیزش است )بوردن26، 1391). امروزه با توجه به رشد روز افزون جمعيت انساني و نياز به منابع پروتئين حيواني، رشد سريع حيوانات اهلي از اهميت ويژهاي برخوردار است. پيش بيني ارزش اصلاحي افراد به طور معمول با استفاده از فنوتيپ انجام ميشود. با وجود صحت بالاي انتخاب فنوتيپي در پيش بيني ظرفيت ژنتيكي افراد، در برخي صفات نميتوان از روي فنوتيپ به عملكرد واقعي حيوانات پي برد. امروزه در راستاي حل اين مشكل متخصصان اصلاح دام تلاش ميكنند تا به كمك روشهاي ژنتيك مولكولي اطلاعات بيشتري از مكانيسم ژنتيكي صفات اقتصادي به دست آورند و با اطلاعات فنوتيپي تلفيق كنند، تا با انتخاب صحيحتر و سريعتر، به روند اصلاح دام سرعت ببخشند. بررسي ميزان تنوع و چند شكلي حاصل از اين ژنهاي مؤثر در رشد و توليد در حيوانات ميتواند راهنماي مفيدي براي اصلاح گران دام در زمينههاي بهنژادي و انتخاب حيوانات با تولید بهتر و با کیفیتتر باشد. تحقیقات نشان دادهاند پیشرفت برنامههای اصلاح نژادی تا حدود زيادي به ميزان تنوع ژنتيكي در جمعيتهاي مورد بررسي بستگي دارد، بنابراين شناسايي تنوع نژادهاي بومي كشور و حفاظت آنها از وظایف اصلی متخصصین اصلاح نژاد دام میباشد (محمدآبادی و همکاران، 2010).
شناسايي و استفاده از ژنهاي مؤثر بر صفات اقتصادي اهميت زيادي در برنامههاي بهنژادي حيوانات دارند (مؤذنی و همکاران، 1391).
2-13 نشانگرهای ژنتیکی
نشانگرها به عنوان نشانهای برای شناسایی حامل آن صفت مورد استفاده قرار میگیرند. به طور کلی هر صفتی که بین افراد متفاوت باشد، ناشی از تفاوت موجود بین ردیف دی. اِن. اِ کروموزومهای آن است که به نتاج منتقل میشود. این تفاوتها میتوانند به عنوان نشانه یا نشانگر ژنتیکی به کار گرفته شوند (نقوی و حسینی سالکده، 1384).
تنوع در توالیهای دی. اِن. اِ موجودات زنده به شکلهای متفاوتی ظاهر میشود. این تفاوتها میتواند در صفات مورفولوژیکی تجلی یابد یا اینکه در پروتئینهای یک موجود زنده (چه از نظر اندازه یا ساختار فضایی) نمود پیدا کند و یا اینکه از سطح دی. اِن. اِ فراتر نرود. تفاوتهای اخیر را تنها با آنالیز دی. اِن. اِ میتوان ارزیابی کرد.
انواع نشانگرهای ژنتیکی به شرح زیر میباشند:
نشانگرهای مورفولوژیکی
نشانگرهای فیزیولوژیکی
نشانگرهای سیتوژنتیکی
نشانگرهای پروتئینی
نشانگرهای فنوتیپی
نشانگرهای مولکولی
2-13-1 نشانگرهای مورفولوژیکی
تفاوت موجود بین ردیف دی. اِن. اِ کروموزومهای هر ارگانیزم که از افراد به نتاج آنها منتقل میگردد و میتواند به عنوان نشانه یا نشانگر ژنتیکی به کار گرفته شود. این تفاوت میتواند به طرق مختلفی تظاهر یابد برخی از این تفاوتها به صورت عرضی بوده و در صفات قابل رؤیت در آزمایشات مندلی تجلی مینمایند این گونه نشانهها را نشانگرهای مورفولوژیکی مینامند.
2-13-2 نشانگرهای فیزیولوژیکی
مطالعات مربوط به بعضی صفات نشان میدهد که افزایش تولید با افزایش سطح برخی از هورمونها در پلاسما همراه است پس میزان این هورمونها میتواند به عنوان یک نشانگر فیزیولوژیک محسوب شود. اشکال نشانگرهای فیزیولوژیک این است که این نشانگرها (از جمله سطح هورمونها در پلاسمای خون) علاوه بر ژنها به شدت تحت تاثیر محیط داخلی، سن و جنس هستند.
2-13-3 نشانگرهای سیتوژنتیکی
در بسیاری موجودات زنده تفاوتهایی در گستره کروموزومی مشاهده میشود که میتوانند به عنوان نشانگر به کار روند. تلوسنتریکها، جابجاییها و الگوهای نواربندی (G, C, R, Q و غیره) از جمله این نشانگرها میباشند.
2-13-4 نشانگرهای مولکولی
نشانگرهای RFLP اولین نشانگرهای توسعه یافته و مطمئنترین روش برای تشخیص پلیمورفیسم میباشند. خاصیت اختصاصی بودن لوکوس، دستهبندی دقیق ژنوتیپها را امکانپذیر میکند. این ویژگی باعث کاربرد گسترده آنها در مطالعات نقشهیابی مقایسهای بین گونههای خویشاوند میشود. با این وجود آنالیز RFLP از نظر هزینه و وقت مقرون به صرفه نبوده و نیاز به مقدار نسبتا زیادی دی. اِن. اِ دارد. این محدودیتها بهوسیله معرفی نشانگرهای مبتنی بر پی. سی. آر مانند RAPD، ریزماهوارهها و AFLP رفع شده است. هر چند که هیچکدام از این تکنیکهای جایگزین بدون عیب نیستند. به عنوان مثال نشانگر RAPDبرای تهیه نقشههای پیوستگی ژنتیکی در گونههای گیاهی استفاده میشود، اما موارد استفاده این تکنولوژی به علت غیراختصاصی بودن آنها تنها به پروژههای نقشهیابی وسیع محدود میشود. از طرف دیگر ریزماهوارهها، نشانگرهای همبارزی هستند که سطوح بالاتری از تنوع آللی را نسبت به RAPD و RFLP شناسایی میکنند. ریزماهوارهها برای ساختن نقشههای متراکم ژنوم پستانداران مانند انسان و موش مورد استفاده قرار گرفتهاند. ریزماهوارهها میتوانند سطوح بالاتری از تنوع آللی را در گیاهان شناسایی کنند اما به پرایمرهای اختصاصی آلل نیاز دارند. اخیرا تکنیک توسعه یافته AFLP مورد استفاده قرار میگیرد که ظرفیت آزمایش تعداد بیشتری از لوکوسها را برای شناسایی پلیمورفیسم نسبت به RAPD و ریزماهوارهها دارد. این مزیت حتی در مورد مقایسه داخل گونهای جایی که پلیمورفیسم خیلی کمتر است نیز صدق میکند. به علاوه AFLP این مزیت را دارد که نیازی به اطلاعات توالی اولیه ندارد. روش جدیدتری از نشانگرهای (مارکرهای) مولکولی پلیمورفیسم ناشی از نوکلئوتیدهای منفرد (SNP) است که عمومیترین شکل پلیمورفیسم دی. اِن. اِ محسوب میشود که میتوان در یک ژنوم پیدا کرد. گمان میرود که یک SNP بهطور متوسط در فواصل 1000-300 باز وجود داشته باشد. عبارت مترادف دیگری که میتوان به جای مفهوم SNP به کار برد کلمه نشانگر دو آللی است که به این صورت تعریف میشود: دو آللی که ممکن است در یک موقعیت نوکلئوتیدی مشخص در یک سلول دیپلوئید با هم متفاوت باشند. به SNPها میتوان به دید نشانگرهایی نگاه کرد که احتمالاً در نسل آینده میتوانند باعث تکمیل و یا حتی جایگزین نشانگرهای موجود شوند که اکنون در آزمایشگاهها به طور معمول استفاده میشوند. یکی از علل جذابیت SNPها امکان شناسایی آنها با استفاده از سیستمهای غیر مبتنی بر ژن است. موفقیت بالای اینها همراه با سیستمهای اتوماسیون که در حال توسعه و پیشرفت هستند امکان استفاده از SNP را در سیستمهای مختلف فراهم میسازد. اگرچه در مجموع دادههای محدودی از SNP در گیاهان و جانوران وجود دارد ولی اخیراً مطالعات زیادی در این زمینه خصوصا در گیاه آرابیدوپسیس27 انجام شده است (گلهداری و همکاران، 1385).
2-13-4-1 انواع نشانگرهای دی. اِن. اِ
2-13-4-1-1 نشانگرهای مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز
تفاوت طول قطعات هضم شده محصولات پی. سی. آر28
تفاوت طول قطعات قابل تکثیر29
تفاوت فرم فضایی رشتههای منفرد30
تکثیر تصادفی دی. اِن. اِ پلیمورف31
ریزماهوارهها32
انگشتنگاری با دی. اِن. اِ تکثیر شده33
پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی34
تفاوت طول قطعات حاصل از تکثیر35
موقعیت توالی نشاندار36
ردیفهای بیان شده نشاندار37
2-13-4-1-2 نشانگرهای غیر مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز
تفاوت طول قطعات حاصل از هضم دی. اِن. اِ توسط آنزیم محدودگر38
پویش ژنومی نشانههای هضم39
ماهوارکها40
تعداد متغیرهای تکرارهای متوالی41 (فرهادی، 1392).
جدول 3-2 مقایسه کلی ویژگی انواع نشانگرها
SNPAFLP Microsatellite RADP RFLP Minisatellite ویژگی عالی عالی عالی عالی عالی متوسطپراکندگیضعیف ضعیف عالی متوسط ضعیف عالی چند شکلیبله خیر بله خیر بله بله هم بارزیقابل قبولقابل قبول سریع قابل قبولقابل قبول سریعمیزان جهشعالی متوسط متوسط متوسط متوسط خیلی کمسرتاسری بودنعالی متوسط عالی ضعیف عالی ضعیفتوانایی موضعیخیلی زیاد خوب خوب کم خوب ضعیفتکرار پذیری (قره ویسی، 1389)
2-14 تکنیکRFLP PCR-
در این روش دی. اِن. اِ استخراج شده به وسیله آنزیم محدودکننده که عمدتاً توالی 4 تا 6 تایی را به طور اختصاصی بر روی ژنوم شناسایی کرده و سپس در جایگاه ویژهای، درون توالی شناسایی ژنوم را میشکند، برش داده میشود. قطعات حاصل از فعالیت آنزیمی توسط الکتروفورز روی ژل (آگارز یا اکریل آمید) جدا شده و بعد از رنگ آمیزی قطعاتی که دارای طول و وزن مشابهای هستند به صورت یک باند ظاهر میشوند این قطعات را “چند شکلی موجود بین طول باندها” مینامند. در ژنوم بزرگی مانند ائوکاریوتها باید از تکنیک دو رگگیری با کاوشگرهای42 دی. اِن. اِ خالص مانند سی. دی. اِن. اِ43 یا گنجینههای ژنومی برای شناسایی تفاوت طول قطعات حاصل از هضم دی. اِن. اِ توسط آنزیمهای محدودگر استفاده شود (نیکلاس، 1996).
از محاسن RFLP میتوان به:
بالابودن تکرار پذیری و دقت و قابلیت اعتماد این نشانگر
بالا بودن فراوانی آن
تحت تاثیر عوامل محیطی داخلی و خارجی نبوده و صد درصد ژنتیکی است
همبارز میباشد
RFLP دارای معایبی همچون:
هزینه اولیه بالا
نیاز به مقدار نسبتا زیاد دی. اِن. اِ
در گونههای بسیار نزدیک این نشانگرها آلل مشابهای را نشان میدهند (گله داری، 1385).
2-15 آنزیمهای برشی
آنزیمهای برشی آنزیمهایی هستند که ردیف خاصی از دی. اِن. اِ را شناسایی میکنند و آنها را در یک نقطه برش میدهند. ردیفهای مورد شناسایی آنزیمهای محدودگر ممکن است 4 تا 8 نوکلئوتید طول داشته باشند، بیشتر این ردیفها پالیندروم44 هستند.
این آنزیمها را گاهی آنزیمهای برشی یا محدودکننده نیز مینامند (گلهداری و همکاران، 1385). منشاء اکثر این آنزیمهای برشی باکتریها میباشند و تا کنون حدود 200 نوع آنزیم محدود کننده جداسازی شده و توالیهای مورد شناسایی آنها نیز تعیین شده است. به طور کلی دو نوع برش به وسیله آنزیمهای اندونوکلئازی محدود کننده ایجاد شده و منجر به تولید دو سری مختلف از قطعهی دی. اِن. اِ میشود.
انتهای چسبناک: این برشها به وسیله آنزیمها ایجاد میشوند که پس از برش با این آنزیمها قطعاتی حاصل میشوند که در انتها تک رشتهای هستند و قادرند که بار دیگر به وسیله پیوندهای هیدروژنی به هم متصل شوند.
انتهای صاف: این برشها به وسیلهی آنزیمهایی ایجاد میشوند که رشته دی. اِن. اِ را به طور عمودی برش میدهند و در نتیجه قطعاتی با انتهای صاف به وجود میآورند که قادر به اتصال مجدد به یکدیگر نمیباشند (امتیازی و کریمی، 1386).
2-15-1 انواع آنزیمهای محدودکننده
آنزیمهای محدودکننده نوع I: این آنزیمها به ATPو SAM (آدنوزین مونو فسفات) به عنوان کوفاکتور واکنش نیاز دارند.
آنزیمهای محدودکننده نوع II: آنزیمهای این دسته به Mg به عنوان کوفاکتور نیاز دارند.
آنزیمهای محدودکننده نوع III: این گروه از آنزیمها هر دو فعالیت محدود کنندگی و تعدیلکنندگی توسط یک کمپلکس آنزیمی که شامل زیر واحدهای مختلط است انجام میدهند و به ATP و SAM نیاز ندارند (مهدوی و همکاران، 1386).
2-16 چند شکلی45
وجود تفاوتهای قابل رؤیت که از ژنهایی با فراوانی بینابینی ناشی میشوند پلیمورفیسم یا چندشکلی مینامند، این اصطلاح همچنین در مورد مکانهای ژنی دارای چند آلل نیز بهکار میرود (فالکونر، 1392). جایگاهی را پلیمورف میگویند که برای یک ژن، دو یا چند آلل در آن وجود داشته باشد و همچنین فراوانی آلل کمیاب حداقل 1 درصد و فراوانی آلل فراوانتر حداکثر 99 درصد باشد (صبور علمی غروری، 1384). تنوع در صفات ظاهری، چند شکلی کروموزومی، چند شکلی پروتئینها و چندشکلی و چندشکلی دی. اِن. اِ اشکال مختلف بروز چندشکلی میباشند. چند شکلیهایی که در سطح دی. اِن. اِ وجود دارند، ممکن است در سطح توالیهای کد کننده و یا در توالیهای غیر کد کننده وجود داشته باشند. چند شکلیهای دی. اِن. اِ که در داخل و اطراف توالیهای ساختاری و یا تنظیم کننده یک ژن با اثرات فیزیولوژیک مشخص اتفاق میافتد (مثلاً ژنهای هورمونها و پروتئینهای شیر)، ممکن است به طور مستقیم بر بیان ژن اثر گذار باشند و بدین وسیله در تغییرات فنوتیپی بین افراد از لحاظ صفات تولیدی مشارکت داشته باشند. این نوع چندشکلیها با صفات تولیدی به طور نزدیکی مرتبط میباشند و میتوانند به عنوان نشانگر انتخاب بهکار برده شوند. مطالعات مختلف نشان داده است که تعدادی از جهشهای نقطهای در ژنهای ساختاری که دارای الگوی وراثت مندلی هستند، با صفات کمی دارای اهمیت اقتصادی مرتبط میباشند، به عنوان مثال چند شکلی پروتئینهای شیر با تفاوتهای موجود در ترکیب و خصوصیات فرآوری شیر مرتبط میباشد. تغییرات موجود در توالیهای غیر کد کننده (مثلاً در مناطق بین ژنی) به طور غیر مستقیم به عنوان نشانگر جهت تجزیه و تحلیل پیوستگی به کاربرده میشوند (مکپیاک46، 2001). امروزه با به کارگیری تکنیکهای مولکولی و استفاده از نشانگرهای دی. اِن. اِ امکان شناسایی ساختار اصلی سیستمهای ژنی و تنوع موجود در جوامع برای نواحی ویژهای در سطح ژنوم و انتخاب بر اساس نشانگرهای مولکولی فراهم آمده است (هانوتی47 و همکاران، 2005). جمعیتهای چند شکل انعکاس دهنده یک خزانه ژنی مطلوب میباشند. یک جایگاه زمانی چند شکل خواهد بود که اولاً برای یک ژن دو یا چند آلل وجود داشته باشد و ثانیاً از آلل نادر و کمیاب حداقل 01/0 درصد و از آلل فراوانتر 99/0 درصد در بین اعضای جمعیت وجود داشته باشد (ولیزاده و مقدم، 1377).
2-17 تنوع ژنتیکی48
تنوع ژنتیکی شامل تنوع دروننژادی و بیننژادی میباشد (کانتانن49 و همکاران، 2000). اصلاحگران از تنوع ژنتیکی برای رسیدن به حیوانات اهلی منطبق بر احتیاجشان بهرهگیری مینمایند. فقدان تنوع، قدرت انتخاب موجود برای رفع نیازهای غیر قابل پیش بینی آتی را محدود میسازد. تنوع دروننژادی پیوسته با تنوع جدید ناشی از جهش مواجه است ولی تنوع ژنتیکی بیننژادی را نمیتوان به راحتی بازسازی نمود. هر نژاد یا سویه حاصل فرآیندهای جهش، رانش ژنتیکی، تکامل و سازگاری مجزایی است که طی قرون متمادی حاصل گردیده است (هدریک50، 1999). احتمالاً متجاوز از 4500 نژاد و سویه حیوان اهلی در جهان وجود دارند که ذخایر ژنتیک حیوانی جهان را تشکیل میدهند که بیش از 30 درصد آنها در معرض خطر انقراض بوده و تعداد بسیار بیشتری نیز به واسطه بهرهبرداری نادرست تهدید میگردند (کوشوا51 و همکاران، 1996). بنابراین با حفظ نمونههایی از تمامی نژادهای یک گونه که دارای بیشترین تفاوت ژنتیکی میباشند، میتوان حداکثر تنوع ژنتیکی را حفظ نمود (گیووامباتیستا52 و همکاران، 2001). این نمونهها نژادهایی را شامل میگردند که دارای آللها یا ترکیبات آللی منحصر به فرد میباشند. شرح کامل تفاوت ژنتیکی بین هر دو نژاد امکانپذیر نیست ولی معیارهای فاصله ژنتیکی بهترین شرح در دسترس برای بیان تفاوت ژنتیکی آنها میباشند (بارکر53، 1994). هتروزیگوتها طیف وسیعی از ژنوتیپها را به وجود میآورند. همچنین موجودات هتروزیگوس از نظر صفات اقتصادی مانند رشد، باروری و مقاومت به بیماریها اهمیت زیادی دارند. هتروزیگوسیتی در یک جمعیت به دو شکل هتروزیگوسیتی مورد انتظار و هتروزیگوسیتی مشاهده شده بیان میگردد (گای54 و همکاران، 2005). بر اساس قانون هاردی- وینبرگ در یک جمعیت که در آن آمیزشها به صورت تصادفی انجام میپذیرد، در صورت عدم وجود مهاجرت، جهش و انتخاب، فراوانیهای ژنی و ژنوتیپی از نسلی به نسل دیگر ثابت باقی میماند. به علاوه، بین فراوانیهای ژنی و ژنوتیپی رابطهی سادهای وجود دارد. جمعیتی که فراوانی ژنی و ژنوتیپی ثابتی داشته باشد، جمعیت در حال تعادل هاردی- وینبرگ نامیده میشود (فالکونر، 1392). به منظور بررسی تعادل هاردی- وینبرگ در یک جمعیت میتوان از آزمون کای مربع استفاده نمود. یکی از محدودیتهای این روش این است که نمیتوان از آن در مواردی که فراوانی مورد انتظار در فنوتیپها کمتر از 5 است، استفاده نمود. از آنجایی که فرمول کای مربع از یک توزیع پیوسته (توزیع نرمال) مشتق شده است و در بسیاری از مسائل ردههای فنوتیپی مجزا مورد بحث قرار میگیرند، اصلاحی در محاسبات کای مربع صورت گرفته است تا این عدم پیوستگی را تصحیح نماید. اصلاح │oi- ei│ یک قدر مطلق (مثبت) است (استانسفیلد، 1387):
فرمول (2-1) (∑_(i=1)^n▒〖[ │o_i- e_i│-0.5]2 〗)/e_i X2 = (اصلاح شده)
در رابطه بالا ∑_(i=1)^n▒ نشان دهنده جمع حالاتی است که در آن دستههای I از 1 تا n افزایش مییابند، همچنین oi و ei به ترتیب نشان دهنده اعداد مشاهده شده و اعداد مورد انتظار در آن دسته میباشند. فراوانی یک ژنوتیپ معین، نسبت یا درصد افراد آن ژنوتیپ در میان کل افراد است. در یک جایگاه ژنی با دو آلل A و a، در صورت در دست بودن فراوانیهای ژنوتیپی افراد، فراوانیهای ژنی آن مکان را میتوان به صورت زیر به دست آورد:
(فرمول 2-2) ((2NAA+ Naa))/2N F(A)= p=
(فرمول 2-3) ((2Naa + Naa))/2N F(a)= q =
در این رابطه p و q به ترتیب فراوانی آللهای A و a میباشند و N نشان دهنده تعداد افراد موجود از هر یک از ژنوتیپها در جمعیت میباشد. در این حالت بر اساس قانون هاردی- وینبرگ فراوانی ژنوتیپهای AA، Aa و aa در نتاج به ترتیب برابر p2، 2pq و q2 خواهد بود و مجموع فراوانیها برابر با یک میباشد:
(فرمول 2-4) 1 = q2 + 2pq + p2
با توجه به توضیحات بالا، هتروزیگوسیتی مورد انتظار را میتوان با استفاده از فرمول زیر محاسبه نمود:
(فرمول 2-5) 2pq = He ن
همچنین هتروزیگوسیتی مشاهده شده در یک جایگاه ژنی را میتوان به کمک فرمول زیر بدست آورد:
(فرمول 2-6) (∑▒〖 N_ij 〗)/N = Ho
در این رابطه N_ij، تعداد افراد هتروزیگوت و i و j نوع آللها در جایگاه ژنی مورد مطالعه میباشند و N تعداد کل افراد جمعیت است. هتروزیگوسیتی مورد انتظار نسبت به هتروزیگوسیتی مشاهده شده کمتر تحت تاثیر نمونهبرداری قرار میگیرد و به همین دلیل در مطالعات کاربرد بیشتری پیدا کرده است (مکاره چیان، 1381).
2-18 جهش (موتاسیون)
هر گونه تغییر ارثی در توالی دی. اِن. اِ را جهش مینامند (مارینوس55، 2001). این جهش ممکن است در فنوتیپ ارگانیسم تاثیر بگذارد یا بیتاثیر باشد. چنین تغییراتی ممکن است به طور خود به خود اتفاق بیافتد یا به عنوان نتیجهای از تیمار با یک عامل مخرب دی. اِن. اِ القا شده باشد (اشعه ایکس، اشعه ماوراء بنفش، مواد شیمیایی، و غیره). جهش میتواند فنوتیپ یک میکروارگانیسم را از راههای مختلفی تغییر دهد. جهش مورفولوژیکی، تغییر مورفولوژی سلولی و کلونیکال56 میکروارگانیسمهاست. جهش کشنده، زمانی که بیان میشود، منجر به مرگ میکروارگانیسم میشود. هر چند که همانندسازی دی. اِن. اِ عاری از خطاست ولی گاهی اشتباهاتی در آن رخ میدهد. یک اشتباه در همانند سازی منجر به تولید یک مولکول دختری میشود که دارای یک جفت شدگی ناجور است، که در آن دو نوکلئوتید مقابل هم در مارپیچ دو گانه مکمل هم نیستند. هنگامی که این مولکول دختری به نوبه خود همانند سازی میکند، دو مولکول نوه تولید شده یکسان نیستند، یکی توالی نوکلئوتیدی درست دارد، ولی دیگری واجد یک جهش است. بنابراین یک جهش به طور ساده عبارتست از یک تغییر در توالی نوکلئوتیدی یک مولکول دی. اِن. اِ، جهشها از طریق مواد جهشزای شیمیایی و فیزیکی نیز ایجاد میشوند. مواد شیمیایی گوناگون با مولکول دی. اِن. اِ واکنش انجام میدهند و ساختمان یک یا چند نوکلئوتیدی را در داخل مارپیچ دوگانه تغییر میدهند. گرما، نور فرابنفش و سایر جهشزاهای فیزیکی نیز اثرات مشابهای دارند. یک جهش ممکن است در داخل ژن یا در نواحی بین ژنی اتفاق بیفتد. اگر جهشی در ناحیه بین ژنها اتفاق بیافتد احتمالاً خاموش بوده اثر قابل تشخیصی بر سلول ندارد. ولی چنانچه جهش در داخل یک ژن واقع شود میتواند فرآورده ژن را تغییر دهد و دگرگونی قابل مشاهدهای در موجود ایجاد نماید. این تغییر به عنوان تغییر در فنوتیپ گفته میشود (براون، 1953).

2-19 واکنش زنجیرهای پلیمراز
پی. سی. آر57مخفف واکنش زنجیرهای پلیمراز است که در سال 1985 توسط کری مولیس و همکاران (که برنده جایزه نوبل شد) ابداع شد (اسریدهار58،2006 و گلمحمدی و همکاران،1387). اساس پی. سی. آر بر کپیبرداری از سکانس دی. اِن. اِ یا آر. اِن. اِ نمونه مورد نظر میباشد که بر این اساس میتوان بیماریهای مختلفی از جمله بیماریهای خونی و ژنتیکی مانند بتا تالاسمی، آنمی سیکل سل و سیستیک فیبروزیس و غیره را تشخیص داد. پی. سی. آر علاوه بر انسان در حیوانات نیز برای تشخیص بیماریهای مختلف از جمله عفونی کاربرد دارد (آیت اللهی و همکاران، 1389). با استفاده از این روش میتوان از یک مولکول دی. اِن. اِ بینهایت نسخه ساخت، حتی اگر در ابتدا در یک مخلوط، مولکولهای دی. اِن. اِ متفاوتی وجود داشته باشد. از این روش برای بسط یک توالی خاص دی. اِن. اِ (هدف) بین موقعیتهای شناخته شده (دو انتها) در دو رشته مولکولهای دی. اِن. اِ استفاده میشود. با پی. سی. آر میتوان هر دو دی. اِن. اِ تک رشتهای و دو رشتهای را تکثیر نمود. برای انجام عمل پی. سی. آر باید حداقل یک بخش از توالی مولکول دی. اِن. اِ هدف که قرار است نسخه برداری شود، شناسایی شده باشد. به طور کلی، پی. سی. آر میتواند دی. اِن. اِ کوچک هدف با طول 100-10 جفت باز59 را بسط دهد. استفاده از این تکنیک تکثیر قطعههای هدف با طول بیشتر از bp5000 (اسریدهار، 2006) را امکان پذیر میکند. واکنش زنجیرهای پلیمراز اجازه میدهد تا مولکولهای دی. اِن. اِ مورد نظر (معمولاً توالیهای ژنی) در یک واکنش آنزیمی ساده تکثیر شده و مقدار کافی از دی. اِن. اِ کپی شده برای آنالیز و دستکاری دقیق تولید شود (جوشی و دشپاندل60، 2011). یک جفت پرایمر الیگو نوکلئوتید تک رشتهای، که مکمل ردیف شناخته شده دو انتهای قطعه مورد نظر دی. اِن. اِ هستند، باید سنتز شوند. آغازگرها مکمل دو انتهای توالی هدف هستند، اما در رشتههای مخالف قرار گرفتهاند. پرایمرها معمولاً 30-20 نوکلئوتید طول دارند و به نواحی مکمل در طرفین در انتهای ´3 اتصال مییابند (اسریدهار، 2006).

2-19-1 اصول PCR
واکنش زنجیرهای پلیمراز یک تکنیک قدرتمند است و استفاده از این روش پیشرفتهای زیادی را در توانایی ما برای آنالیز ژنها ایجاد کرده است. دی. اِن. اِ ژنومی در سلولهایی وجود دارد که حاوی هزاران ژن هستند. بنابراین جداکردن و آنالیز هر یک از ژنها کار دشواری است. اما پی. سی. آر این اجازه را میدهد تا توالی دی. اِن. اِ خاص، که معمولاً ژنها یا بخشی از ژنها هستند، از دی. اِن. اِ ژنومی در یک واکنش آنزیمی ساده تکثیر شود. شرط لازم برای این کار شناسایی بعضی از توالی دی. اِن. اِ در هر یک از انتهاست که قرار است تکثیر شود. دی. اِن. اِ مورد نظر توسط پی. سی. آر به بیش از یک میلیون برابر کپی و بسط داده میشود و مولکول دی. اِن. اِ در واکنش غالب میشود. با استفاده از این روش دی. اِن. اِ کافی برای آنالیز جزئیات یا دستکاری ژن تکثیر شده به دست میآید (ویلی و سونس، 2005).
2-19-2 اجزای پی. سی. آر
در فرایند پی. سی. آر، دی. اِن. اِ در یک واکنش آنزیمی که انکوباسیون در سه دمای متفاوت رخ میدهد، تکثیر میشود. هر فرایند دی. اِن. اِ از 4 جزء اصلی تشکیل شده است.
2-19-2-1 دی. اِن. اِ الگو
کیفیت الگو نتیجه پی. سی. آر را تحت تاًثیر قرار میدهد. برای مثال، مقادیر زیاد آر. اِن. اِ61 در الگوی دی. اِن. اِ با یونهای Mg2+ ترکیب شده و کارایی پی. سی. آر را کاهش میدهد. علاوه بر این مقدار الگو در یک واکنش بر عملکرد پی. سی. آر مؤثر است (نیوتن و گراهام، 1381).

2-19-2-2 بافر پی. سی. آر
شامل تریس، نمک مثل کلرید پتاسیم یا سولفات آمونیوم (شاهحسینی و همکاران، 1380).

2-19-2-3 کلرید منیزیوم (Mgcl2):
یکی از اجزای مهم واکنش پس. سی. آر میباشد که افزایش غلظت یون منیزیوم موجب افزایش دمای مرحله وا سرشته سازی و افزایش فعالیت پلیمرازی آنزیم تکپلیمراز (این آنزیم برای فعالیت پلیمرازی خود به یون آزاد منیزیوم نیاز دارد) میگردد (شاهحسینی و همکاران، 1380).

2-19-2-4 آنزیم تکپلیمراز62
این آنزیم که به شکل طبیعی یا نوترکیب تولید میشود، از سایر انواع دی. اِن. اِ پلیمرازها معروفتر و شناخته شدهتر بوده و بیشتر از آنها مورد استفاده قرار میگیرد. حسن این نوع آنزیم، مقاومت به درجه حرارت بالا (95-90 درجه سانتیگراد) آن است. علاوه بر این آنزیم تک میتواند قطعات دی. اِن. اِ برابر 80-75 درجه سانتیگراد است که در دمای 70 درجه سانتیگراد بیش از 65 نوکلئوتید در ثانیه پلیمریزه میشود (هالتن63، 2000).
2-19-2-5 دیاکسی نوکلئوزید تریفسفاتها
نوکلئوتیدها که همان واحدهای سازنده دی. اِن. اِ میباشند، از مواد مهم مورد نیاز واکنش پی. سی. آر هستند. آنزیمهای دی. اِن. اِ پلیمراز، ساخت زنجیره پلی نوکلئوتیدی را از این مونومرها یا واحدها کاتالیز مینمایند. کیفیت و مقدار تک نوکلئوتیدها مورد استفاده، در کارآیی و اختصاصی بودن پی. سی. آر مؤثر است. چنانچه مقدار تک نوکلئوتیدها بیشتر از نیاز واکنش باشد امکان تشکیل نقاط آغازین اشتباه64 و تشکیل قطعات غیر اختصاصی وجود دارد (شاهحسینی، 1380).
2-19-2-6 آغازگرها65
در طی واکنش پی. سی. آر، آغازگرها به دو طرف توالی هدف اتصال یافته و امکان آغاز فعالیت پلیمرازی آنزیم دی. اِن. اِ پلیمراز را فراهم میآورند. از این رو مهمترین ویژگی آغازگرها، توالی صحیح آن برای مکان مورد تکثیر میباشد. طویل بودن آغازگر (آغازگرهایی با طول بیش از 30 باز) امکان اتصال آنها به خود و به یکدیگر را تشدید مینماید و زمان اتصال را نیز افزایش میدهد (شاهحسینی، 1380). جهت محاسبه دمای ذوب آغازگرها در پی. سی. آر، روشها و معادلات گوناگونی وجود دارد. ایدهآل آن است که دمای ذوب هر دو پرایمر رفت و برگشت مانند هم یا نزدیک به هم باشد (محمدآبادی، 1386). مقدار آغازگری که در یک پی. سی. آر استفاده میشود بستگی به نوع آزمایش دارد. غلظت بالای آغازگر باعث بسط غیر اختصاصی و ایجاد پرایمر- دایمر میشود. با توجه به طیف فعالیت آنزیم تکپلیمراز که در محدوده 70 تا 85 دمای اتصال آغازگر در محدوده 55 تا 72 درجه سانتیگراد به طور معمول بهترین نتیجه را میدهد. مدت زمان بسط بستگی به عواملی مانند طول توالی هدف، غلظت توالی هدف و دمای تکثیر دارد. بسط آغازگر به طور معمول در دمای 72 درجه سانتیگراد انجام میشود (شاهحسینی و همکاران، 1380).
2-19-2-6-1 66OD پرایمر
OD، معرفی از غلظت است و بنابراین هرچه مقدار OD بالاتر باشد، مقدار پرایمر بیشتر خواهد بود و برای تعداد بیشتری نمونه قابل استفاده است. هرچه تعداد واکنشهای پی. سی. آر بیشتر باشد مقدار بیشتری از پرایمر نیز مورد نیاز است.
2-20 کاربردهای واکنش زنجیرهای پلیمراز
تهیه نسخههای متعدد از یک ژن
بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در مخلوطی از دی. اِن. اِ
تشخیص قبل از تولید بیماریهای ژنتیکی
تعیین جنسیت جنین
بررسی عفونتهای باکتریایی و ویروسی
تشخیص جهش و سرطان (امتیازی، 1386).
2-21 هورمونها



قیمت: تومان

دسته بندی : مقاله و پایان نامه

دیدگاهتان را بنویسید