دانشکده علوم

پایان نامه کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی (علوم سلولی و مولکولی)

تولید و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس 1390 BR

به کوشش
سیده مائده میرتبار درزی

استاد راهنما
دکتر حمیدرضا کربلایی حیدری

اسفند ماه 92

به نام خدا

اظهارنامه
اینجانب سیده مائده میرتبار درزی (900503) دانشجوی رشته زیست شناسی گرایش علوم سلولی و ملکولی دانشکده علوم دانشگاه شیراز اظهار مینمایم که این پایاننامه حاصل پژوهش خودم بوده و در جاهایی که از منابع دیگران استفاده کردهام، نشانی دقیق و مشخصات کامل آن را نوشتهام. همچنین اظهار میکنم که تحقیق و موضوع پایاننامهام تکراری نیست و تعهد مینمایم که بدون مجوز از دانشگاه دستاوردهای آن را منتشر ننموده و یا در اختیار غیر قرار ندهم. کلیه حقوق این اثر مطابق با آیین نامه مالکیت فکری و معنوی متعلق به دانشگاه شیراز است.

نام و نام خانوادگی: سیده مائده میرتبار درزی
تاریخ و امضاء: 18/12/92

تقدیم به او
که سرچشمهی زلال حقیقت است.
به او که در وسعت بیکران حضورش، آرام آرام بالیدم
و در شعلههای داناییاش تاریکیهای جهالتم را روشن ساختهام.

تقدیم به پدرم
به ستون استوار زندگیام،
که هرجا قدمهایم لرزیده است، به بلندای جاودان مهربانیاش تکیه دادهام.

تقدیم به مادرم
به ساکن آشنای قلب تپندهام.
تقدیم به فروغ آشنای چشمهایش،
که لحظه لحظههای بودنم در ایثار بیدریغ دعاهایش محصور گشته است.

تقدیم به برادرانم
که در تمام زندگیام به اعتماد بودنشان سربلند بودهام.

سپاسگزاری
سپاس ایزد منان را، که به من توفیق رسیدن به این مرحله تحصیلی را عطا فرمود. به جاست تا دراین مختصر، قدران زحمات پدر و مادر عزیزم که گرمای امیدبخش وجودشان بهترین پشتیبان من بوده و حضور برادران عزیزم در کنارم، که خستگی‌های این راه را به امید و روشنی راه تبدیل می‌کرد. همچنین قدردان زحمات استاد راهنمای ارجمندم جناب آقای دکتر حمید رضا کربلایی حیدری هستم که علاوه بر علم، درس زندگی را به من آموختند.

چکیده

بهینه سازی تولید و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس 1390BR

در پژوهش حاضر ترشح و بررسی خصوصیات آلفا آمیلاز خارج سلولی از باکتری بومی باسیلوس لیکنیفورمیس 1390BR مد نظر بود. سویه 1390BR در محیط حاوی عصاره مخمر 5/0%، پپتون 5/0% و کلرید سدیم 5/0% و آب شهر 5% در دمای ˚C30 و 7~pH کشت داده شد و پس از گذشت مدت زمان 24 ساعت، توسط نشاسته 1/0 % القا گردید. نتایج بیشترین میزان ترشح را 18 ساعت پس از القا نشان داد. آنزیم توسط روش رسوبدهی با استن (v/v)70% و ستون کروماتوگرافی تعویض یونیDEAE-Cellulose تا حد امکان تخلیص گردید. خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم تخلیص شده در حضور 5/0% نشاسته نشان داد pH و دمای بهینه آنزیم به ترتیب 0/6 و ˚C 70 میباشد و در دمای ˚C 85 پس از گذشت یک ساعت کمتر از 25% فعالیت خود را از دست میدهد. این آنزیم در محدوده وسیعی از pH (5-12) بیش از 60% فعالیت خود را حفظ میکند. پارامترهای سینتیکی Vmax و Km آلفا آمیلاز سویه 1390BR به ترتیب برابر µM/s 42/0 و mg/ml 02/1 محاسبه شد. فعالیت آنزیم در حضور یونهای Mn2+ و Ca2+ بمدت یک ساعت به میزان 105 و 107% افزایش مییابد و در حضورFe3+ بطور کامل مهار گردید. فعالیت آمیلولیتیک آنزیم در حضور mM5EDTA سبب کاسته شدن تنها 27% از فعالیت اولیه آنزیم گردید. پایداری آنزیم در محدوده وسیع دما و pH و عدم وابستگی شدید فعالیت آنزیم به حضور یون Ca2+ در محیط، این آنزیم را یک کاندید مناسب برای جایگزینی بعضی از آمیلازهای صنعتی امروزی مینماید.
کلمات کلیدی: آلفا آمیلاز، باسیلوس لیکنیفورمیس، پایداری دمایی، صنعت نشاسته

فهرست مطالب

عنوان صفحه
فصل اول1
(مقدمه)1
1- مقدمه2
1-1- آنزیمها2
1-2- منابع بیوکاتالیزوری2
1-2-1- کاربردهای صنعتی بیوکاتالیزورها4
1-3- نشاسته5
1-4- آمیلازها6
1-4-1- منابع آلفا آمیلازها7
1-4-1-1- آمیلازهای باکتریایی7
1-4-1-2- آمیلازهای قارچی7
1-4-2- طبقه بندي آمیلازها8
آنزیمهای هیدرولیز کننده نشاسته به چهار گروه عمومی تقسیم میشوند:8
الف) اندو آمیلازها8
ب) اگزو آمیلازها8
ج) آنزیمهای شاخه شکن8
د) تراسفرازها8
1-4-2-1- اندو آمیلازها8
1-4-2-2- اگزو آمیلازها9
1-4-2-3- آنزیمهای شاخه شکن9
1-4-3- ساختار آمیلازها11
1-4-4- مکانیسم عمل آلفا-آمیلاز13
1-4-5- کاربردهای آلفا-آمیلازها14
1-4-5-1- تولید اتانل زیستی15
1-4-5-2- صنایع شوینده16
1-4-5-3- صنایع نساجی16
1-4-5-4- کاغذ سازی17
1-4-5-5- صنایع غذایی17
1-5-4-6- تولید نان و شیرینی پزی17
1-4-5-7- تولید شربت گلوکز و فروکتوز18
فصل دوم20
2- مروری بر پژوهش¬های پیشین21
فصل سوم25
3- ابزار، مواد و روشهای تحقیق26
3-1- ابزار27
3-2- مواد28
3-2-1- بافرها28
3-2-2- مواد شیمیایی28
3-2-3- محیطهای کشت مورد نیاز28
3-1-4-کشت باکتری مولد آلفا آمیلاز و تشخیص کیفی تولید آنزیم خارج سلولی30
3-2- بررسي سينتيک رشد و فعاليت آلفا آمیلازی باکتري در محيط کشت پايه30
3-3- روشهاي استفاده شده در مراحل سنجش و تخليص آلفا آمیلاز31
3-3-1- تخلیص آنزیم آلفا آمیلاز31
3-3-2- تخلیص بر روی ستون DEAE-Cellulose31
3-3-3- سنجش فعاليت آنزيمي32
3-3-3-1-روش سنجش فعالیت آنزیم33
3-3-3-2-واحد آنزیمی33
3-3-4- سنجش پروتئين34
3-3-4-1- سنجش کمي پروتئين به روش برادفورد34
3-4- روشهاي بررسي خصوصيات بیوشیمیایی آلفا آمیلاز با خلوص نسبی35
3-4-1- اثر غلظتهاي مختلف سوبسترا بر فعاليت آلفا آمیلاز (تعیین Km و Vm)35
3-4-2- اثر دما بر فعاليت آلفا آمیلاز با خلوص نسبی37
3-4-3- اثر pH بر فعاليت آلفا آمیلاز37
3-4-4- بررسي پايداري حرارتي آنزیم دارای خلوص نسبی37
3-4-5- اثر pH بر پايداري آنزيم دارای خلوص نسبی37
3-4-6- روش بررسي اثر يونهاي فلزي و EDTA بر فعالیت آنزيمی38
4- نتایج40
4-1- ترشح آنزیم آلفا آمیلاز از باسیلوس لیکنیفورمیس سویه 1390BR40
4-2- سینتیک رشد و تولید آنزیم آلفا آمیلاز41
4-3- تخلیص و شناسایی آنزیم آلفا آمیلاز از باسیلوس لیکنیفورمیس 1390BR42
4-4- خصوصیات بیوشیمیایی آلفا آمیلاز43
4-4-1- اثر pH و دما بر فعالیت آلفا امیلاز43
4-4-2- اثر دما بر پایداری آلفا آمیلاز سویه 1390 BR44
4-4-3- اثر pH بر پایداری آنزیم آلفا آمیلاز45
4-6- اثر غلظتهاي مختلف سوبسترا بر فعاليت آمیلاز 1390BR ( تعیین Km و Vmax)46
4-7- اثر يونهاي فلزي بر فعالیت آنزيم47
5- بحث و نتیجه گیری50
پیشنهادات54

فهرست جدولها

عنوان صفحه
جدول 1- 1. کاربردهای مختلف آنزیمها.4
جدول 1-3) ترکیبات بافر Mix28
جدول 3-2) نام و اجزاء محیط کشتهای مورد استفاده.29
جدول 3-2) اجزاء محیط کشت جامد29
جدول 3-3. موادلازم در تهیه محلول برادفورد.35
جدول 4-1) اثر یونهای فلزی بر فعالیت آنزیم.48

فهرست شکلها

عنوان صفحه
شکل 1-1) منابع تجاری آنزیمها.3
شکل 1-2) گرانول نشاسته در گیاهان مختلف (الف: نشاسته سیب زمینی شیرین، ب: نشاسته سیب زمینی، ج: نشاسته گندم، د: نشاسته ذرت و هـ: نشاسته برنج)5
شکل 1-3) ساختار آمیلوز (الف) و آمیلوپکتین(ب).6
شکل 1-4) انواع آمیلازها و عملکرد و محصول آنها.10
شکل 1-5) دُمینهای A، B و Cو اسید آمینههای کاتالیتیک در آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس12
شکل 1-6) یونهای کلسیم در ساختار آلفا آمیلاز.13
شکل 4-1) کلنی باکتری 1390BR در محیط نشاسته- آگار. هاله تشکیل شده اطراف کلنیها نشان دهنده فعالیت آلفا آمیلازی میباشد.40

فهرست نمودارها

عنوان صفحه
نمودار 3-1) منحنی استاندارد غلظتهای مختلف D-مالتوز در طول موج nm 54034
نمودار 4-1) رشد باکتری 1390BR41
نمودار 4-2) تولید آنزیم برحسب زمان پس از القا نشاسته 1/0%41
نمودار 4-3) کروماتوگرام ستون DEAE Cellulose42
نمودار 4-4( اثر pH بر فعالیت آلفا آمیلاز در دمای ˚C 70. فعالیت نسبی به عنوان درصدی از حداکثر فعالیت دیده شده در0/6 ~pH میباشد که 100% در نظر گرفته شده است.43
نمودار 4-5( اثر دما بر فعالیت آنزیم در0/ 7~pH. فعالیت نسبی به عنوان درصدی از حداکثر فعالیت دیده شده در دمای ˚C 70 میباشد که 100% در نظر گرفته شده است.44
نمودار 4-6) پایداری فعالیت آنزیمی در دماهای مختلف در طی زمان45
نمودار 4-7) پایداری آلفا آمیلاز در pH مختلف پس از یک ساعت انکوباسیون45
نمودار 4-8) نمودار میکائیلیس- منتن 46
نمودار 4-9) نمودار هانس- ولف47

فصل اول
(مقدمه)

1- مقدمه
1-1- آنزیمها
آنزیمها، پروتئینهای کروی و مسئول بسیاری از واکنشهای ضروری بیوشیمیایی در میکروارگانیسمها، گیاهان و جانوران هستند. آنزیمها نقشهای مختلفی ایفا میکنند و بدون اینکه خودشان تغییر یابند، توانایی منحصر به فردی در تسـهیل و تسـریع واکنش شیمیایی دارند (Mojsov et al., 2012).
در سیستم طبقه بندی بین المللی آنزیمها1 براساس عملکرد به شش دسته تقسیم میشوند:
EC1: اکسیدوردوکتازها؛ کاتالیز واکنشهای اکسیداسیون- احیا
EC2: ترانسفرازها؛ کاتالیز انتقال گروههای عاملی
EC3: هیدرولازها؛ کاتالیز آبکافت پیوندها
EC4: لیازها؛ افزودن گروهها به پیوند دوگانه یا ایجاد پیوندهای دوگانه با برداشت گروه
EC5: ایزومرازها؛ کاتالیز ایزومریزاسیون درون یک ملکول
EC6: لیگازها؛ کاتالیز اتصال کووالان دو ملکول همراه با تجزیهATP .

1-2- منابع بیوکاتالیزوری
آنزیمها از منابع میکروبی، حیوانی و گیاهی بدست میآیند. منابع میکروبی شامل باکتریها، قارچها و مخمرها هستند که 80 درصد کل آنزیمها از این منابع تأمین میشود. منابع گیاهی و جانوری نه تنها محدود هستند بلکه فرایند خالصسازی آنها نیز دشوارتر میباشد. همچنین به دلیل داشتن خاصیت ایمنوژنیسیتی2 در کاربردهای بالینی کمتر مورد استفاده قرار میگیرند. در حالی که آنزیمهای میکروبی فاقد این محدودیت میباشند و در فرایند تخمیر به مقدار زیاد تولید میشوند. آنزیمهای میکروبی اغلب خارج سلولی هستند و جداسازی آنها بسیار راحتتر است و در مقایسه با آنزیمهای گیاهی و جانوری پایدارتر میباشد. میکروارگانیسمها برای تولید آنزیم از مواد ارزان قیمت و در دسترس استفاده میکنند. منابع مورد استفاده در فرایند تخمیر برای تولید آنزیم باید ارزان قیمت باشد تا آنزیم تولیدی برای کاربردهای صنعتی مربوطه مقرون به صرفه باشد. همچنین دستکاری ژنتیکی میکروارگانیسمها آسانتر بوده و سرعت تولید در این بیوکاتالیزورها بسیار بالاست.

شکل 1-1) منابع تجاری آنزیمها.

1-2-1- کاربردهای صنعتی بیوکاتالیزورها
قرنهاست که مواد غذایی مانند نان، پنیر، ماست و سرکه از طریق فرایندهای بیولوژیک تولید میشود. به دلیل عدم امکان استفاده از اسیدها و بازهای قوی، حلالها یا کاتالیزورهای شیمیایی سمّی در این صنعت، کاربرد آنزیمهای میکروبی بسیار گسترش یافته است. جدول 1-1 برخی از کاربردهای صنعتی آنزیمهای مختلف را نشان میدهد.
جدول 1- 1. کاربردهای مختلف آنزیمها.
مورد استفاده آنزیم الکل α-آمیلاز، β-آمیلاز، پروتئاز، آمیلوگلوکوزیداز اسید آمینه اسید آمینه آسیلاز غذای حیوانات β-گلوکاناز، همی سلولازها، آمیلاز، پروتئاز، فیتاز نان α-آمیلاز، β-آمیلاز، β-گلوکاناز، پروتئاز پنیر سازی رنت، لیپاز، پروتئاز شویندهها پروتئاز، لیپاز، آمیلاز وسلولاز قلیایی محصولات فر آوری شدهی تخم مرغ گلوکز اکسیداز، کاتالاز، لیپاز آب میوه پکتیناز، همی سلولازها، سلولاز، آمیلاز لاکتوز لاکتاز مخمری چرم پروتئاز، کربوهیدراتاز، لیپاز لیپید لیپاز گوشت پروتئاز فاضلاب پروتئاز، سلولاز، مخلوط آنزیمی

1-3- نشاسته
پس از سلولز، نشاسته دومین پلیساکارید اصلی موجود در طبیعت است که در گیاهان به عنوان یک محصول فتوسنتزی در پلاستیدها3ی برگ گیاهان ساخته و به عنوان منبع انرژی در زمان تاریکی مصرف میشود. همچنین در آمیلوپلاستها4ی غده، دانه و ریشه به عنوان یک ترکیب برای ذخیره سازی طولانی مدت سنتز میشود. آمیلوپلاست در بعضی موارد به اندازه 70% ماده تر5 گیاه از نشاسته تشکیل شده است و مقدار زیاد نشاسته میتواند به صورت گرانولهای محلول در آب تجمع یابد. اندازه، شکل و درجه کریستاله شدن گرانولها اغلب به گونههای گیاهی که در آن تشکیل شده است، بستگی دارد (شکل 1-2) (Aiyer et al.,2005; Sharma et al., 2013(1); Van (Der Maarel et al., 2002

شکل 1-2) گرانول نشاسته در گیاهان مختلف (الف: نشاسته سیب زمینی شیرین، ب: نشاسته سیب زمینی، ج: نشاسته گندم، د: نشاسته ذرت و هـ: نشاسته برنج)

نشاسته پلیساکاریدی ناهمگن6 است و از دو جزء آمیلوز7 و آمیلوپکتین8 با وزن ملکولی بالا تشکیل شده است؛ بطوری که به ترتیب 25-28% و 72-75% از گرانولهای نشاسته را تشکیل میدهند. آمیلوز، پلیساکارید نامحلول در آب با زنجیره خطی D-گلوکز با اتصال (α(1→4 است؛ ولی آمیلوپکتین، پلیساکارید منشعب و محلول در آب است که از زنجیره اصلی با اتصال (α(1→4 و زنجیره جانبی با اتصال (α(1→6 به زنجیره اصلی تشکیل شده است(Sharma et al., 2013(1)).

شکل 1-3) ساختار آمیلوز (الف) و آمیلوپکتین(ب).

1-4- آمیلازها
آمیلازها آنزیمهایی هستند که مولکول نشاسته را هیدولیز و به محصولات متنوع از جمله دکسترین و به تدریج به الیگومرهای کوچکتر دارای واحدهای گلوکز تبدیل میکنند. این آنزیم دارای اهمیت زیادی با برنامههای بیوتکنولوژی گستردهای در صنایع نان ، مواد غذایی، نساجی و کاغذ میباشد. آمیلاز حدود 25 درصد از بازار آنزیم را دارا میباشد. آلفا-آمیلازهایی با پایداری دمایی بالا کاربردهای تجاری زیادی در صنایع پردازش نشاسته، تولید شربت و نوشیدنی، حذف آهار پارچه در نساجی و تولید شوینده دارند. پایداری دمایی خصوصیت مطلوب اغلب آنزیمهای صنعتی است. آلفا آمیلازهای استخراج شده از باکتریهایی مانند سویههای باسیلوس لیکنیفورمیس9، باسیلوس سویه ANT-610 و باسیلوس سویه ASMIA-211 دارای پایداری دمایی مناسبی میباشند (Asgher et al., 2007; Arikan et al., 2008)

1-4-1- منابع آلفا آمیلازها
به دلیل نقش مهم آلفا آمیلازها در متابولیسم کربوهیدراتها، این آنزیمها توسط گیاهان، جانوران و میکروارگانیسمها تولید میشوند. آمیلاز باکتریایی و گیاهی قرنهاست که به عنوان افزودنیهای غذایی استفاده میشود. منابع میکروبی با توجه به مزیتهایی مانند کاهش قابل توجه هزینه و نیاز به زمان و فضای کمتر برای تولید انبوه، سهولت دستورزی آنزیم برای بهبود خصوصیات و همچنین سهولت بهبود و بهینه سازی فرایند به منظور تولید صنعتی آمیلاز، بطور گسترده استفاده میشود (;Souza et al., 2010 Sivaramakrishnan et al., 2006).

1-4-1-1- آمیلازهای باکتریایی
در میان باکتریها، گونههای باسیلوس به طور گستردهای برای تولید آلفا-آمیلاز مقاوم به حرارت به منظور رفع نیازهای صنعتی استفاده میشود. باسیلوس سوبتلیس12، باسیلوس استرئوس ترموفیلوس13، باسیلوس لیکنیفورمیس و ﺑﺎﺳﯿﻠﻮس آﻣﯿﻠﻮلیکویی ﻓﺴﯿﻨس14 به عنوان تولیدکنندگان اصلی آلفا آمیلاز شناخته شدهاند و به طور گستردهای برای تولید تجاری آلفا آمیلاز برای کاربردهای مختلف استفاده میشود (Sivaramakrishnan et al., 2006).

1-4-1-2- آمیلازهای قارچی
.در بین قارچها، تنها گونههایی از قارچهای مزوفیل مانند آسپرژیلوس15 و پنی سلیوم16، آلفا آمیلاز تولید میکنند. گونههای آسپرژیلوس انواع مختلفی از آنزیمهای خارج سلولی تولید میکنند که در بین این آنزیمها، آمیلازها دارای بیشترین اهمیت صنعتی میباشد (Hernández et al.,2006). قارچهای رشته ای مانند قارچ آسپرژیلوس اوریزه17 و آسپرژیلوس نایجر18 به طور گسترده در صنعت استفاده میشوند. به عنوان مثال آسپرژیلوس اوریزه یک میزبان مناسب برای تولید پروتئینهای هترولوگ میباشد. همچنین این قارچ تا حد زیادی در تولید مواد غذایی مانند سس سویا، اسیدهای آلی مانند اسید سیتریک و اسید استیک و آنزیمهای تجاری از جمله آلفا آمیلاز استفاده میشود. آسپرژیلوس نایجر آلفا آمیلازی تولید میکند که تحمل شرایط اسیدی را دارد و این ویژگی آنزیمی باعث اجتناب از آلودگی باکتریایی میشود (Souza et al., 2010).

1-4-2- طبقه بندي آمیلازها
آنزیمهای هیدرولیز کننده نشاسته به چهار گروه عمومی تقسیم میشوند:
الف) اندو آمیلازها19
ب) اگزو آمیلازها20
ج) آنزیمهای شاخه شکن21
د) تراسفرازها22

1-4-2-1- اندو آمیلازها
اندو آمیلازها آنزیمهایی هستند که پیوندهای گلیکوزیدی داخلی را هیدرولیز میکنند (Rana et al., 2013). آلفا آمیلاز یا 1,4-α گلوکان -4-گلوکانوهیدرولاز (EC 3.2.1.1) متعلق به خانواده گلیکوزید هیدرولاز 1323 میباشد و با برش (4-1)-D-α گلیکوزیدی؛ این آنزیم آمیلوز و آمیلوپکتین را هیدرولیز میکند و الیگوساکاریدهای خطی یا منشعب با طول مختلف دارای کنفیگوراسیونهای α و α-دکسترین24 و α- گلوکز تولید میکند (Sharma et al., 2013(1); Van Der Maarel et al., 2002).
1-4-2-2- اگزو آمیلازها
اگزو آمیلازها آنزیمهایی هستند که پیوندهای گلیکوزیدی نزدیک به انتهای غیر احیا کننده را هیدرولیز و محصولاتی با وزن ملکولی پایین مانند گلوکز و مالتوز تولید میکنند (Rana et al., 2013).

گلوکوآمیلازها25 (EC 3.2.1.3)و آلفا گلوکوزیدازها26 (EC 3.2.1.20) پیوندهای (4,1)α و (6,1)α گلیکوزیدی را هیدرولیز و β-گلوکز تولید مینمایند ( Horvathova et al., 2000; Rana et al., 2013).

بتا-آمیلازها27 (EC 3.2.1.2) پیوند (4,1)α گلیکوزیدی را هیدرولیز و β-مالتوز28 و β-دکسترین29 تولید میکنند (Rana et al., 2013) (تصویر 1-3).

1-4-2-3- آنزیمهای شاخه شکن
آمیلازهای شاخه شکن آنزیمهایی هستند که تنها پیوند (1,6)α گلیکوزیدی را هیدرولیز میکنند (Horvathova et al., 2000).

پولولانازها30 یا α-دکسترین 6-گلوکونو هیدرولاز31 (E.C. 3.2.1.41) جزء آنزیمهای شاخه شکن میباشد که پیوندهای داخلی (1,6)α- D گلیکوزیدی موجود در پولولان32، β -دکسترین33 و آمیلوپکتین را هیدرولیز کرده و مالتو تریوز تولید میکند (Asha et al.,2013).

ایزوآمیلازها34 (EC 3.2.1.68) پیوند (1,6)α-گلیکوزیدی آمیلوپکتین و پلی ساکاریدهای مشابه و دکسترین منشعب را هیدرولیز و مالتوالیگوساکاریدهای خطی تولید میکند (Horvathova et al., 2000).

شکل 1-4) انواع آمیلازها، عملکرد و محصول آنها.

1-4-3- ساختار آمیلازها
به منظور بدست آوردن اطلاعاتی درباره ساختار و کونفورماسیون پروتئینها معمولاً از تکنیکهای CD-اسپکتروسکوپی35، NMR36 و کریستالوگرافی اشعه X37 استفاده میشود. آمیلازها حاوی سه دُمین38 A، B و C هستند. دُمین A مرکز آنزیم و شامل یک ساختار مرکزی TIM-barrel 8(β/α) متشکل از 8 مارپیچ α و 8 زنجیره β موازی میباشد. در تمامی آلفا آمیلازها (مانند آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس) دُمین A دارای سه اسید آمینه D231، E261 و D328 در جایگاه فعال میباشد. دُمینهای B و C در دو طرف دُمین A قرار دارند. دُمین B بین زنجیره سوم و مارپیچ سوم TIM-barrel قرار دارد و ساختاری نامنظم و شبیه β تشکیل میدهد. این دُمین مسئول احتمالی تفاوت در پایداری و ویژگی سوبسترا میباشد. دُمین C دارای موتیف کلید یونانی39 در انتهای کربوکسیل پروتئین میباشد (شکل 1-5). انتهای کربوکسیل احتمالاً در انتقال از عرض غشاء، اتصال به نشاسته و پایداری دمایی آنزیم نقش دارد (sharma et al.2013 (1)). آلفا آمیلازهایی که تاکنون شناخته شدهاند دارای حداقل یک یون کلسیم در حد فاصل دُمین A و B میباشند البته استثنائاتی نیز وجود دارد. حضور یون کلسیم برای فعالیت و یا پایداری دمایی آنزیم ضروری است و این یون به دلیل دور بودن از جایگاه فعال، نقش ساختاری دارد. بسیاری از ساختارها دارای یک یا چند یون کلسیم (Ca2+) هستند. اولین یون کلسیم (Ca Ι) بسیار حفاظت شده است که در تمام خویشاوندان آلفا آمیلاز وجود دارد. این یون کلسیم Ι، دُمین A را به دُمین B متصل و باعث پایداری ساختار جایگاه فعال میشود و تشکیل جایگاه اتصال سوبسترا را کنترل میکند. دومین یون کلسیم (Ca ІІ) در کنار Ca І قرار دارد و به همراه یون سدیم، Ca–Na–Ca سه تایی فلزی40 را میسازند. این ترکیب 3 گانه فلزی در بعضی از آمیلازهای باکتریایی دیده میشود. کلسیم سوم (Ca ІІІ) نیز در حد فاصل دُمین A و C بعضی آلفا آمیلازها دیده میشود (شکل 1-6). فقدان یونهای فلزی در آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس تغییرات کونفورماسیونی مختلفی را اطراف سه تایی فلزی و جایگاه فعال ایجاد میکند. علاوه بر یون کلسیم، یون کلرید (Cl-1) نیز در جایگاه فعال بعضی از آلفا آمیلازها وجود دارد که بازده کاتالیتیک آنزیم را افزایش میدهد. یون کلرید عمدتاً در آلفا آمیلاز پستانداران وجود دارد(Nielsen et al., 1999; Sharma et al.2013 (1); Sharma et al.2013 (2)) .

شکل 1-5) دُمینهای A، B و Cو اسید آمینههای کاتالیتیک در آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس

شکل 1-6) یونهای کلسیم در ساختار آلفا آمیلاز.

1-4-4- مکانیسم عمل آلفا-آمیلاز
تمامی آلفا آمیلازها دارای سه اسید آمینه در جایگاه فعال (مانند D231، E261 و D328 در آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس) که از لحاظ توالی و ساختار سه بعدی بسیار حفاظت شده و برای فعالیت آنزیم ضروری میباشند. معالعه روی اسید آمینههای کاتالیتیک (D193،E219 و D294) آلفا آمیلاز تولید کننده مالتوتترااوز41 باکتری سودوموناس استوتزری42 نشان داد واکنش از کاتالیز اسید- باز عمومی تبعیت میکند. در این آنزیم اتم اکسیژن زنجیره جانبی D193 بعنوان کاتالیست بازی (هسته دوست43) به اتم کربن 1 در چهارمین گلوکز حمله میکند و حد واسط واکنش را تشکیل میدهد. اسید آمینه D294 به سوبسترا متصل میگردد و به ایجاد انحراف و پیچش حلقه چهارمین گلوکز در موقعیت کربن 1 کمک میکند تا واکنش تسهیل شود. زنجیره جانبی اسید آمینه E219 به عنوان یک کاتالیست اسیدی (دهنده پروتون) عمل میکند و با اتم اکسیژن در چهارمین گلوکز پیوند هیدروژنی تشکیل میدهد (شکل 1-7) ((1) Sharma et al., 2013).

شکل 1-7) اسید آمینههای کاتالیتیک جایگاه فعال آلفا آمیلاز باکتری سودوموناس استوتزری.

1-4-5- کاربردهای آلفا-آمیلازها
آمیلازها از جمله مهمترین آنزیمهای جهان هستند که در بیوتکنولوژی روز دنیا اهمیت بسیاری دارند. این دسته آنزیمی در زمینههای مختلفی مانند بالینی، داروسازی، شیمی تجزیه و همچنین صنایع مختلف مانند در صنایع تولید شربت گلوکز و فروکتوز از نشاسته، نساجی، کاغذ و تولید اتانل زیستی و غیره کاربرد دارد (Souza et al., 2010). بدلیل اهمیت صنعتی آمیلاز، جداسازی سویههای باکتریایی تولید کننده آمیلاز مناسب برای کاربردهای جدید صنعتی مانند آمیلازهای قلیایی مناسب برای صنایع شوینده مورد توجه قرار گرفته است (Arikan et al., 2008).
چندین گونه از جنس باسیلوس و همچنین اکتینومیسس44 مقاوم به حرارت از جمله ترمومونوسپورا45 و ترمواکتینومیسس46 آنزیمهای مختلفی تولید میکنند. جنس باسیلوس انواع زیادی از آنزیمهای خارج سلولی تولید میکند که در میان آنها پروتئاز و آمیلاز از اهمیت صنعتی قابل توجهی برخوردار است. آلفا آمیلاز قلیایی و بسیار مقاوم به حرارت از باسیلوس سویه PN5 به دست آمده است. باکتری گرمادوست باسیلوس استرئوترموفیلوس جایگزین مناسبی برای تولید تجاری آلفا آمیلاز مقاوم به حرارت پیشنهاد شده است. مزایای استفاده از آمیلازهای مقاوم به حرارت در فرایندهای صنعتی شامل کاهش خطر آلودگی و همچنین حلالیت بهتر سوبسترا میباشد و مزیت دیگر آن کاهش گرانروی47 است که اجازه تسریع مخلوط کردن و پمپاژ را میدهد. وجود آمیلازهای قند ساز48 که در دمای بالا (C˚90) فعال هستند، به طور مستقیم برای صنایع پردازش نشاسته مفید میباشد. با این حال، فرآیندهای در حال اجرای تولید آلفا آمیلاز در دمای بالاتر نیازمند طراحی فرایندهای جدید و داشتن دانش بیشتر درباره باکتریهای گرمادوست میباشد. گونههای باسیلوس قلیا دوست اغلب آنزیمهایی مانند آمیلاز، پروتئاز و کربوکسی متیل سلولاز قلیایی تولید میکنند که در pH قلیایی فعال هستند (Arikan et al., 2008).

1-4-5-1- تولید اتانل زیستی
به دلیل نیاز به تولید سوخت از منابع تجدید پذیر، تولید اتانل زیستی از نشاسته به شدت افزایش یافته است. در صنعت با استفاده از مواد حاوی نشاسته مانند دانه ذرت، گندم، سیب زمینی، ریشه گیاه کاساوا49 و برگ و ساقه گیاه ذرت اتانل تولید میشود. اغلب مخمرها نمیتوانند کربوهیدرات گیاهان حاوی نشاسته را بطور مستقیم تخمیر کنند. بنابراین نشاسته ابتدا آسیاب و سپس هیدراته و ژلاتینه میشود. در ادامه توسط آنزیمها به قندهای قابل تخمیر تبدیل میشود. ولی استفاده از سویه مهندسی ژنتیک شده مخمر که دارای قابلیت تبدیل مستقیم نشاسته به اتانل میباشد، از لحاظ وقت و هزینه مقرون به صرفه میباشد. بطور مثال اگر آمیلاز جو در ساکارومایسس سروزیه50 بیان شود، مخمر میتواند نشاسته را به اتانل تبدیل کند و هزینه تولید صنعتی به میزان زیادی کاهش مییابد (Nigam et al.,1995; Rana et al., 2013).

1-4-5-2- صنایع شوینده
صنایع شوینده اولین مصرف کننده آنزیمها از نظر مقدار و هزینه میباشد. استفاده از آنزیمها در شوینده باعث افزایش توانایی حذف لکه میشود و از لحاظ محیط زیست نیز ایمن محسوب میشود. امروزه بسیاری از مواد لباسشویی حاوی مخلوطی از آنزیمهایی مانند پروتئاز، آمیلاز، سلولاز و لیپاز هستند. به دلیل هیدرولیز پیوندهای گلیکوزیدی ملکول نشاسته موجود در لکههای مواد غذایی، آمیلاز پس از پروتئاز دومین آنزیمی است که در صنعت شوینده استفاده میشود. به علت چسبیدن مواد به نشاسته، حذف نشاسته از سطح لباس یا ظروف به تمیز شدن آن کمک میکند. بین آنزیمهایی که برای شوینده استفاده میشود آلفا آمیلازها پرمصرف ترین میباشد. آمیلازهای دارای فعالیت در pH قلیایی و دمای بالا و دارای پایداری لازم در شوینده و پایداری اکسیداتیو مهمترین شرایط برای استفاده از آنزیم در شوینده میباشد. اغلب آمیلازهای تجاری از جنس باسیلوس یا آسپرژیلوس بدست میآیند ( Souza et al., 2010;Hmidet et al., 2009).

1-4-5-3- صنایع نساجی
آمیلاز در صنعت نساجی برای فرآیند حذف آهار51 استفاده میشود. آهار را قبل از تولید پارچه به نخ اضافه میکنند تا از آسیبهای ناشی از سرعت بافتن جلوگیری و از استحکام پارچه مطمئن شوند. نشاسته به دلیل قیمت ارزان، در دسترس بودن و حذف آسان، بسیار مناسب آهار میباشد. پس از بافت پارچه، نشاسته طی فرایندی از آن حذف میشود. آلفا آمیلاز میتواند بطور انتخابی آهار را حذف کند اما به الیاف پارچه آسیب نرساند. مدت زیادی است که آمیلازهای سویههای باسیلوس در صنایع نساجی مورد استفاده قرار میگیرند (Souza et al., 2010).

1-4-5-4- کاغذ سازی
به منظور استحکام کاغذ و محافظت از آن در برابر آسیبهای مکانیکی طی روند تولید از نشاسته دارای گرانروی کم استفاده میشود. به این منظور ابتدا نشاسته توسط آلفا آمیلاز بطور جزئی هیدرولیز و سپس در دمای حدود C˚60-45 به کاغذ اضافه میشود (Mojsov et al., 2012).

1-4-5-5- صنایع غذایی
آمیلاز دارای کاربردهای گستردهای در صنایع پردازش مواد غذایی مانند تولید نان، کیک و آب میوه و همچنین تولید شربت گلوکز و فروکتوز از نشاسته میباشد. آمیلاز برای هیدرولیز غذای دام به منظور سهولت هضم آن مورد استفاده قرار میگیرد. بعضی از آمیلازها به دلیل توانایی شیرینکنندگی بالا، به عنوان جایگزین شیرین کنندهها در غذاها و نوشیدنیها مورد استفاده قرار میگیرد (Mojsov et al., 2012; Nigam et al., 2002).
1-5-4-6- تولید نان و شیرینی پزی
به دلیل داشتن مزایای زیاد استفاده از آنزیم و نداشتن اثرات جانبی افزودنیها، استفاده از آنزیم در صنعت پخت نان تقریبا عمومی شد. بین آنزیمها، آمیلاز، لیپاز، پروتئاز، همیسلولاز، پنتوزانوز52 و اکسیداز بیشتر مورد استفاده قرار میگیرند. این آنزیمها هیدرولیز نشاسته، کربوهیدرات غیر نشاستهای، چربیها و پروتئینها را کاتالیز میکنند. از آلفا آمیلازها بیش از سایر آنزیمها در پخت نان استفاده میشود که به دلیل افزایش حجم نان، بهبود دانههای نان، رنگ و پوسته نان، بهتر شدن عطر و طعم محصول نهایی میباشد. اخیراً اثر ضد بیاتشدگی53 در هنگام استفاده از آلفا آمیلاز مشاهده شد که این اثر به علت به تأخیر انداختن کریستاله شدن آمیلوپکتین در طول ذخیرهسازی نان است. با این حال، تنها آلفا آمیلاز باکتریایی دارای پایداری حرارتی متوسط میتواند برای جلوگیری از بیات شدن نان مورد استفاده قرار گیرد (Rosell et al., 2001).
1-4-5-7- تولید شربت گلوکز و فروکتوز
یکی ازمهمترین کاربردهای آلفا آمیلاز تبدیل نشاسته به شربت گلوکز و فروکتوز است. این فرایند شامل مراحل ژلاتینه شدن54، سیال شدن55 نشاسته و تبدیل به منوساکاریدها56 میباشد (شکل 1-8). مایع شدن و تبدیل به منوساکارید نیاز به هیدرولیز آنزیمی دارند. در مرحله سیال شدن نشاسته ابتدا آلفا آمیلاز بدست آمده از باسیلوس آمیلولیکویی فَسیِنس مورد استفاده قرار گرفت ولی در ادامه آلفا آمیلاز استخراج شده از باسیلوس استرئوترموفیلوس و باسیلوس لیکنیفورمیس جایگزین آن شدند (Rana et al., 2013).

شکل 1-8) مراحل تبدیل نشاسته به شربت

فصل دوم
(مروری بر پژوهشهای پیشین)

2- مروری بر پژوهشهای پیشین
اولین آنزیم تجزیه کننده نشاسته در سال 1811 توسط Kirchhoff کشف شد( Gupta et al., 2003).
در سال 1925 Kuhn و همکاران با محاسبه چرخش نوری، محصول اولیه تولید شده توسط آمیلازهای پانکراس و آسپرژیلوس اوریزه را آلفا- مالتوز و محصول تولید شده توسط آمیلاز مالت را بتا- مالتوز نامید (Kuhn et al., 1925).
در سال 1930 Ohlsson آنزیمهای تجزیهکننده نشاسته در مالت را طبق تیپ آنومری قندهای احیاء شونده به آلفا و بتا آمیلاز دستهبندی کرد (Ohlsson et al., 1930).
در سال1982 Krishnan و همکاران از باسیلوس لیکنیفورمیس سویه CUMC305 یک آلفا آمیلاز با وزن ملکولی kDa 28 خالص کردند. آنزیم استخراج شده در دمای oC90 و 0/9pH~ دارای فعالیت بهینه بود. همچنین مقاومت دمایی بالایی را از خود نشان داد (Krishnan et al.,1982).
در سال 1983 Mielenz و همکاران، ژن آلفا آمیلاز دارای پایداری دمایی از باکتری گرمادوست باسیلوس استئوترموفیلوس کلون57 و در اشرشیا کلی58 بیان کردند (Mielenz et al.,1983).
در سال 1986 Rothstein و همکاران تولید آلفا آمیلاز از باسیلوس لیکنیفورمیس را بررسی کردند. در این پژوهش تولید آنزیم بیش از 100 برابر به حضور یا عدم حضور منبع کربن مهار کننده کاتابولیت در محیط بستگی داشت. در این باکتری آلفا آمیلاز در طی فاز نمایی تولید گردید (Rothstein et al.,1986).
در سال 1998 Igarashi از باسیلوس سویه KSM-1378 یک آلفا آمیلاز استخراج کرد که وزن مولکولی آن 53 کیلو دالتون بود. فعالیت بهینهی این آنزیم در0/8-5/8 pH و دمای oC55 بود. این آنزیم با بازده بالایی کربوهیدراتهای مختلف را به مالتوز یا مالتو پنتوز تبدیل کرد (Igarashi et al., 1998).
در سال 1999 Mamo و همکاران دو آمیلاز، با عنوان AmyI و AmyII را از باسیلوس سویه WN11 خالص کردند. وزن مولکولی آنها به ترتیب 76 و kDa 53 برآورد شد. دمای بهینه فعالیت هر دو آنزیم C˚80- 75 بود و در 5/5~ pH بیشترین فعالیت را داشت. همچنین در محدوده pH 0/9 – 5/5 پایدار بود. فعالیت این آنزیمها در حضور +2Hg، +2Cu و +2Fe مهار شد، اما اثر مهاری در حضور +2Zn مشاهده نشد (Mamo et al., 1999).
در سال 2002 Dey و همکاران با مطالعه باسیلوس سیرکولنس59 GRS 313، آلفا آمیلازی جدا کردند که نشاسته را به مالتو تریاوز و مالتو پنتااوز تبدیل کرد. دما و pH بهینه آنزیم به ترتیب C˚ 48 و 9/4 بود. آنزیم تا دمای C˚ 60 و pHهای0/8-0/5 پایدار بود (Dey et al., 2002).
در سال 2007 Saxena و همکاران روی آلفا آمیلاز قلیایی باسیلوس سویه PN5 مطالعهای انجام دادند. این آنزیم بیشترین فعالیت در 0/10~ pHو دمای C˚ 90 دارا بود. فعالیت آنزیم پس از یک ساعت نگهداری در 0/10~ pH، 80% فعالیت اولیه است. با گرما دهی در دمای C˚ 80-100به مدت 1 ساعت آنزیم کاملاً پایدار بود؛ اما در C˚ 105، 65% فعالیت آن باقی ماند (Saxena et al., 2007).
در سال 2007 Asgher و همکاران از باسیلوس سوبتلیس JS-2004 آلفا آمیلازی را استخراج کردند و اثر کلسیم، عصاره مخمر و گلوکز موجود در محیط کشت بر رشد باکتری و تولید آنزیم مطالعه شد. این سویه پس از 48 ساعت کشت در محیط دارای 0/7~ pH و دمای C˚ 50 حداکثر تولید آنزیم (U/mL 72) را داشت. افزودن کلسیم و عصاره مخمر رشد باکتری و تولید آنزیم را افزایش داد؛ اما افزودن گلوکز %1 اثر مهاری زیادی نشان داد. عصاره آلفا آمیلاز دارای بیشترین فعالیت در دمای C˚ 70 و در 0/8~ pH بود و پس از یک ساعت در دمای C˚ 70 کاملاً پایدار بود (Asgher et al., 2007).

در سال 2008 Arikan و همکاران مطالعهای را روی آلفا آمیلاز قلیایی و دارای پایداری دمایی تولید شده توسط باسیلوس سویه A3-15 انجام دادند. SDS–PAGE دو نوار را در kDa 86 و 5/60 نشان داد. آنزیم پس از تخلیص جزئی بیشترین فعالیت را در 11 pH و دمای C˚ 70 نشان داد. این آنزیم در محدوده قلیایی (5/11-0/10) فعالیت زیادی داشت و تا C˚ 100 کاملاً فعال بود (Arikan et al., 2008).
در سال 2009 Hmidet و همکاران روی باسیلوس لیکنیفورمیس سویه NH1که پنج پروتئاز و یک آلفا آمیلاز تولید میکرد، مطالعهای انجام دادند. pH و دمای بهینه آمیلاز به ترتیب 5/6 و C˚ 90 است. این آلفا آمیلاز داری پایداری دمایی مناسبی بود و هنگامی که با سورفکتانتهای یونی و غیر یونی به مدت 1ساعت در C˚ 40 دما دهی شد، پایدار ماند (Hmidet et al., 2009).
در سال 2010 Božić و همکاران با مطالعه روی باسیلوس لیکنیفورمیس ATCC 9945a آلفا آمیلازی با قابلیت بالای هیدرولیز نشاسته خام تولید کردند. با استفاده از SDS-PAGE وزن مولکولی آنزیم kDa 31 نشان داده شد. بهینه pH آنزیم خالص شده 5/6 و بهینه دمای آنC ◦ 90 بود. نشاسته خام بدست آمده از Triticale، گندم، سیب زمینی، ترب سیاه60 و ذرت در غلظت 1% را به مدت h 4 در معرض آنزیم قرار داد و میزان هیدرولیز به مقادیر 63، 60، 59، 52 و 37 % تعیین شد (Božić et al., 2010).
در سال 2011 Annamalai و همکاران روی آلفا آمیلاز سویهای از باسیلوس سرئوس مطالعه کردند. آنزیم خالص دارای وزن ملکولی kDa42 بود ودارای پایداری حرارتی خوبی میباشد. آلفا آمیلاز دارای بیشترین فعالیت در C˚ 65 و0/8~ pH بود و تا 0/11pH ~، 89% فعالیت آن حفظ شد. با افزودن MnCl2 به آنزیم، فعالیت آن به میزان104% رسید اما آنزیم توسط EDTA مهار میشد (Annamalai et al., 2011).
در سال 2012 Kim و همکاران باکتری باسیلوس سویه AAH-32را از خاک جدا کردند. این باکتری آلفا آمیلاز قلیا دوست61 با پایداری دمایی بالا تولید کرد. وزن ملکولی آنزیم توسطSDS-PAGE ، kDa 91 تخمین زده شد. شرایط بهینه فعالیت آنزیم 5/8pH ~ و دمای C˚ 70 بود. این آلفا آمیلاز در pH بین 3/10-4/6 و دماهای کمتر از C˚ 60 پایدار است (Kim et al. 2012).

اهداف
با توجه به اینکه اغلب آلفا آمیلازهای دارای پایداری دمایی از جنس باسیلوس تولید شدند و نیاز به آلفا آمیلازهای دارای پایداری دمایی به منظور کاربردهای صنعتی در حال افزایش است، در این پژوهش بر آن شدیم تا آلفا آمیلاز حاصل از باسیلوس لیکنیفورمیس سویه 1390BR که سویه ای بومی است را استخراج و خصوصیات بیوشیمیایی آن را بررسی نمائیم.

فرضیه
آنزیم آلفا آمیلاز استخراج شده از باسیلوس لیکنیفورمیس بومی ممکن است خصوصیات منحصر به فردی نظیر پایداری دمایی داشته باشد.

فصل سوم
(مواد و روشها)

3- ابزار، مواد و روشهای تحقیق:

3-1- ابزار
1. هود لامینار ژال تجهیز
2. انکوباتور ریحان طب
3. شیکر-انکوباتور Vision
4. میکروسکوپ نوری
5. سانتریفوژ Sigma 2-16 P
6. ورتکس پدیده نوژن پارس
7. اسپکتروفتومتر Jenway
8. هات بلاک پدیده نوژن پارس
9. استیرر Vision
10. pH سنج Metrohm
11. اتوکلاو ریحان طب
12. کیسه دیالیز Sigma
13. سنتریکان
14. ستون تعویض آنیونی (DEAE-cellulose) Pharmacia

3-2- مواد
3-2-1- بافرها
بافر A: بافر پتاسیم فسفات (KH2PO4)mM 50 (6~pH)
بافر B: تریس mM 20 و کلرید کلسیم mM 2 (8~pH)
بافر C: تریس mM 20 (8~pH)
بافر D: بافر Mix (جدول 3-1)
جدول 1-3) ترکیبات بافر Mix
غلظتماده 20 mMNa-Acetate 20 mMK-Phosphate 20 mMTris-Hcl 20 mMGlycine
3-2-2- مواد شیمیایی
3,5-Dinitrosalicylic acid از شرکت سیگما و سایر مواد شیمیایی مورد نیاز از شرکت Merck تهیه شد.

3-2-3- محیطهای کشت مورد نیاز
برای تولید آلفا آمیلاز مورد نظر از محیط کشت پایه MA استفاده شد (جدول 3-2). همچنین به منظور بررسی بهترین محیط برای تولید آنزیم، چهار محیط کشت (0/7 ~ pH ) که در جدول 3-2 نشان داده شده است، تهیه گردید. برای تشخیص ترشح آلفا آمیلاز از محیط کشت جامد (جدول 3-2) استفاده شد.

جدول 3-2) نام و اجزاء محیط کشتهای مورد استفاده.
MDMCMBMAنوع ماده 51052عصاره مخمر )gr) 51052پپتون )gr) 0050کلرید سدیم )gr) 0301)منوپتاسیم فسفاتgr) 2001آمونیوم سولفات )gr) 100505050آب شهر (ml) تا رسیدن به 1000 ml تا رسیدن به ml 1000 تا رسیدن به ml 1000 تا رسیدن به ml 1000 آب مقطر
جدول 3-2) اجزاء محیط کشت جامد
مقدارنوع ماده 10عصاره مخمر )gr) 10پپتون )gr) 3منو پتاسیم فسفات )gr) 10نشاسته 50آب شهر (ml) تا رسیدن به ml 1000 آب مقطر pH~0/7
3-1-4-کشت باکتری مولد آلفا آمیلاز و تشخیص کیفی تولید آنزیم خارج سلولی
در ابتدا چند استوک از باکتری باسیلوس لیکنیفورمیس سویه BR1390 به منظور سنجش میزان آلفا آمیلاز تولیدی بر روی محیط کشت جامد حاوی نشاسته به مدت 48 ساعت رشد داده شدند. سپس از محلول لوگل جهت رنگآمیزی نمونهها و مقایسه میزان فعالیت استفاده شد. سپس به منظور تعیین بهترین محیط برای تولید آنزیم نمونههای دارای فعالیت مناسب به وسیله لوپ استریل به ارلن مایر 100 میلی لیتری حاوی 25 میلی لیتر محیط پیش کشت و سپس با 1 درصد تلقیح به چهار محیط کشت تولید MA، MB، MC و MD منتقل گردید. نمونهها در شیکر انکوباتور با دمای 30 درجه سانتيگراد و حرکت دورانيrpm 180 رشد داده شد. 24 ساعت پس از تلقیح، تولید آنزیم توسط نشاسته 1/0% القا شد.
همچنين به منظور نگهداري باکتري در کوتاه مدت (برای چند ماه) يک کلني از باکتري در شرايط سترون در محیط مایع کشت داده شد و سلولها پس از سانتریفیوژ در مخلوط مساوی از محیط کشت و گلیسرول 50% استریل قرار گرفت و در فریزر 20- نگهداری شد. نمونهها برای نگهداری بلند مدت در فریزر 80- درجه سانتی گراد منتقل گردید.

3-2- بررسي سينتيک رشد و فعاليت آلفا آمیلازی باکتري در محيط کشت پايه
به منظور بررسي سرعت رشد، باکتري در محيط کشت پايه رشد داده شد و در ادامه ميزان تراکم نوري62 (OD) در طول موج 600 نانومتر در طي 34 ساعت اندازه گيري شد. همچنين ميزان فعاليت آنزيمي آن نيز در ساعتهاي مختلف پس از القا مورد سنجش قرارگرفت.

3-3- روشهاي استفاده شده در مراحل سنجش و تخليص آلفا آمیلاز
3-3-1- تخلیص آنزیم آلفا آمیلاز
در این پژوهش ابتدا محیط کشت حاوی باکتری به مدت 10 دقیقه با دور g5000 سانتریفوژ گردید و سپس محلول رویی که حاوی آلفا آمیلاز بود در دمای ˚C 4، با 50 درصد (v/v) استن سرد رسوبدهی گردید. بدین صورت که استن به آرامی به محلول رویی که بهوسیلهی مگنت بر روی استیرر در حال همزدن بود، اضافه گشت و پس از 30 دقیقه رسوب توسط فیلتر از محلول جدا و به دلیل نداشتن فعالیت آنزیمی دور ریخته شد و محلول رویی توسط استن70 درصد (v/v) رسوب دهی مجدد گردید. سپس در دمای ˚C4 در g 5000 محلول پروتئینی به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ انجام شد و رسوب حاصل در حداقل حجم بافرB حل گردید. نمونه در دمای ˚C 4 در بافر B دیالیز شد و پس از دو بار تعويض بافر به فاصلهی 13 و 5 ساعت (طول کل مدت دیالیز 22 ساعت بود) به عنوان محلول آنزيمي مورد سنجش آنزيمي قرار گرفت.

3-3-2- تخلیص بر روی ستون DEAE-Cellulose
براي تهيه ستون تعويض آنيوني DEAE-Cellulose، از ستوني با قطر 5/2 سانتي متر و طول 10 سانتيمتر رزين استفاده شد. پس از آماده سازي ستون و به تعادل رساندن آن با بافر B، محلول حاوی آنزيم بر روي ستون منتقل گردید و سپس ستون با همان بافر شستشو داده شد تا تمامي پروتئينهايي که به ستون تعويض يوني متصل نشدهاند، خارج شوند. پس از اينکه جذب 280 نانومتر نمونههای خارج شده از ستون به صفر رسيد با استفاده از ايجاد يک گراديان خطي 5/0-0 مولار سديم کلرايد معادل 12 حجم ستون در بافر مشابه، پروتئينهاي متصل شده به رزين برحسب ميزان بار منفي سطحي و قدرت اتصالشان به رزين به ترتيب با افزايش قدرت يوني بافر شستشو از ستون جدا شده و در لولههاي مختلف جمعآوري شد. با توجه به اینکه پس از چند بار انجام تخلیص توسط ستون DEAE-cellulose مشاهده شد که آنزیم مورد نظر قبل از شیب غلظت از ستون خارج می گردد، در دفعات بعد پس از صفر شدن جذب nm 280 ستون با نمک یک مولار شسته شد. با اندازهگيري غلظت پروتئيني نمونهها توسط جذب 280 نانومتر و همچنين تعيين ميزان فعاليت آمیلازی هر يک از فراکسیونهای دارای جذب پروتئینی، آنزیم آلفا آمیلاز مورد نظر جدا گردید. در اين پژوهش نمونهها در لولههاي 3 میلی لیتری با سرعت عبور ml/min 1 جمعآوري گردید. همچنین نمونههای پروتئینی پس از تغلیظ توسط غشای UF با Cut off برابر kDa 10 در فريزر با دماي 20- درجه سانتيگراد قرار گرفت.

3-3-3- سنجش فعاليت آنزيمي
در این پژوهش به منظور تعیین فعالیت آنزیمی از سنجش با معرف 3، 5- دی نیتروسالسیلیک اسید 63 (DNS) استفاده شد و فعالیت آنزیمی آلفا آمیلاز با اندازهگیری آزاد شدن واحدهای مالتوز و یا گلوکز به عنوان گروههای احیا کننده سنجیده شد.
محلولهای مورد استفاده عبارتند از:
1. محلول 5/0% نشاسته
5/0گرم نشاسته قابل حل به ml100 بافر A اضافه گردید و بر روی استیرر قرار گرفت تا نشاسته به آرامی حل شود. محلول حاصل پس از سرد شدن مورد استفاده قرار گرفت.
2. محلول 3، 5- دی نیتروسالسیلیک اسید(DNS) :
ابتدا gr1 DNS در 50 میلی لیتر آب حل شد و به آرامی gr30 سدیم-پتاسیم تارتارات به آن اضافه گردید. سپس با افزودن20 میلی لیتر محلول NaOH 2 مولار رنگ محلول از زرد به نارنجی شفاف تغییر یافت. در نهایت حجم نهایی به 100 میلی لیتر رسانده شد. این محلول تا دو هفته قابل استفاده بود.
3. بافر A
4. محلول آنزیمی

3-3-3-1-روش سنجش فعالیت آنزیم
میزانµl 100 نمونه آنزیمی با غلظت مناسب با µl400 سوبسترای مورد نظر مخلوط و در دمای مشخص به مدت 30 دقیقه انکوبه گردید. سپس به هر نمونه µl500 محلول DNS اضافه و محلول حاصل به مدت 5 دقیقه در حمام آب جوش قرار گرفت. پس از خنک شدن، جذب آن در طول موج nm 540 سنجش گردید. تفاوت جذب نسبت به نمونه شاهد به عنوان فعالیت آنزیمی شناخته میشود که در این رابطه نمونه شاهد حاوی آنزیم، سوبسترا و محلول DNS در لحظه صفر میباشد.

3-3-3-2-واحد آنزیمی
به منظور محاسبه فعالیت آنزیمی بر حسب واحد آنزیمی(unit) منحنی استاندارد رسم گردید. ابتدا غلظتهای متفاوت و متوالی از 0 تا یک میکرومولار D-مالتوز در 10 غلظت تهیه شد. به ml 5/0 محلولهای فوق ml 5/0 DNS اضافه و به مدت 5 دقیقه جوشانده و جذب نمونهها در طول موج nm 540 خوانده شد. پس از ثبت جذب این غلظتها، نمودار استاندارد جذب علیه µmolاز D- مالتوز رسم شد و به کمک آن واحد آنزیمی محاسبه گردید. یک واحد از فعالیت آمیلازی برابر است با مقدار آنزیمی که میتواند یک میکرومول D- مالتوز در یک دقیقه در شرایط مناسب آزاد کند (نمودار 3-1).

نمودار 3-1) منحنی استاندارد غلظتهای مختلف D-مالتوز در طول موج nm 540

3-3-4- سنجش پروتئين
در اين تحقيق براي سنجش مقدار پروتئين از روش برادفورد64 با استفاده از محلول پروتئینی آلبومین سرم گاوی65 (BSA) به عنوان استاندارد استفاده شد. همچنین طي تخليص آنزيم توسط ستون کروماتوگرافي DEAE-Cellulose، ميزان پروتئين با بررسی جذب نمونهها درطول موج nm280 تخمين زده شد.

3-3-4-1- سنجش



قیمت: تومان

دسته بندی : مقاله و پایان نامه

دیدگاهتان را بنویسید