فصل اول- مقدمه و كليات
مقدمه
در بيشتر کشورهاي اروپايي و آسيايي از جمله کشور ما و در برخي نواحي آمريکاي مرکزي، ماهي کپور معمولي1يکي از مهمترين ماهيان پرورشي به شمار مي‌آيد و از معدود گونه هاي ماهي است که مي‌توان آن را به عنوان ماهي اهلي به شمار آورد. ماهي کپور نسبت به اعمال مختلف مانند برداشت محصول، رقم بندي بر حسب اندازه، نقل و انتقال و غيره و نيز نسبت به تغييرات درجه حرارت و ميزان اکسيژن بسيار مقاوم است. اين ماهي از ميزان پرورش بسيار بالايي برخوردار بوده و عليرغم مقاومت نسبتاً بالا, عوامل استرس زا و بيماري هاي متعدد پرورش اين گونه را تهديد نموده که سبب شده گونه مذکور مورد توجه قرار بگيرد(پيغان و همکاران، 1384).
اخيراً استفاده از محرک هاي ايمني در ماهي هاي پرورشي جهت افزايش فعاليت مکانيسم هاي دفاع غير اختصاصي و ايجاد مقاومت در مقابل بيماري ها رايج شده است و اين محرک هاي ايمني جايگزين مناسبي براي آنتي بيوتيک ها معرفي شده اند. استفاده از آنتي بيوتيک ها از جهات مختلف تهديدي براي انسان و محيط زيست مي‌باشد. افزايش تعداد باکتري هاي مقاوم نسبت به آنتي بيوتيک ها، تخريب و تهديد محيط زيست بويژه در مواقعي که آنتي بيوتيک به آبهاي سطحي راه يابد و عوارض جانبي اين داروها بر بدن ماهي از جدي ترين تهديدات استفاده از آنتي بيوتيک ها مي‌باشند(Jian & Wu, 2003; Karatas et al., 2003; Citarasu et al., 2006; Kunttu et al., 2009).
ماهي ها از نظر تكاملي نسبت به حيوانات خونگرم، ابتدايي تر بوده و تكامل كمتري دارند، سيستم ايمني آنها نيز ابتدايي بوده و ايمني ذاتي يا غير اختصاصي نسبت به ايمني اختصاصي نقش بيشتري در محافظت ماهي به عهده دارد. از اينرو برخلاف حيوانات خونگرم در ماهي ها واكسيناسيون كه نوعي تحريك ايمني اختصاصي است جايگاه چنداني ندارد، ولي استفاده از محرک هاي ايمني که تحريک ايمني غير اختصاصي را باعث مي‌شوند، مورد توجه بيشتري واقع گرديده اند(1996 ,.Iwama et al).
در چند دهه اخير استفاده از گياهان دارويي با توجه به مزيت هاي متعدد، ازجمله آثار جانبي کمتر بر موجود زنده و محيط زيست، عدم ايجاد مقاومت دارويي، ارزان بودن، پايدار و در دسترس بودن توجهات زيادي را در سطح جهان بويژه کشورهاي پيشرفته به خود جلب نموده است( رجحان، 1387). از اين رو در بين محرک هاي ايمني متعدد، محرکهاي ايمني با منشاء گياهي ارجحيت دارند. همچنين استفاده از گياهان در درمان بيماريها به ويژه بيماريهاي عفوني در سالهاي اخير روند رو به افزوني پيدا کرده است. لذا با توجه به عوارض جانبي كمتر نسبت به داروهاي شيميايي، گياهان و ترکيبات آنها شامل اسانسها و عصاره هاي گياهي داراي توان بالقوه جهت جايگزيني با داروهاي شيميايي مي‌باشند(Cowan, 1999; Srinivasan et al., 2001; Immanuel et al., 2004).
در بين محرک هاي ايمني مختلف، محرک هاي ايمني با منشاء گياهي کاربرد بيشتري دارند. از طرفي در ماهي بعلت عدم تکامل ايمني اختصاصي و پاسخ پادتني ضعيف، استفاده از واکسن هاي تجارتي علاوه بر گرانقيمت بودن در مقايسه با حيوانات خونگرم کارايي کمتري دارند((Srinivasan et al., 2001. اثبات شده است استفاده از محرک هاي ايمني قدرت مقابله ماهي در برابر استرس هاي محيطي مانند دما، حمل ونقل، کمبود اکسيژن و استرس هاي تغذيه اي را افزايش مي‌دهد (Sakai, 1999; Sahoo & Mukherjee, 2002).
مطالعات مختلفي روي تركيب شيميايي اسانس حاصل از گياهان لعل كوهستان Oliviera decumbens و مرزه خوزستان Satureja khuzestanica انجام گرفته است كه خاصيت ضد ميكروبي آنرا نشان مي‌دهد
(; Sajadi & Hosseini., 2002; Amin et al., 2005 نجف پور نوايي و ميرزا، 1381).
با عنايت به موارد فوق به نظر مي‌رسد استفاده از محرک هاي ايمني مي‌تواند جايگزين مناسبي براي آنتي بيوتيک ها و حتي واکسيناسيون در پيشگيري و کنترل بيماري هاي ماهيان باشند(عليشاهي، 1383).
تعدادي از آئروموناس ها به دليل ايجاد مشکلاتي بزرگ در مزارع پرورشي كپور ماهيان، مورد توجه هستند و اگر چه به عنوان عامل پاتوژن به شمار مي‌روند ولي آنها همچنين بعنوان قسمتي از ميکرو فلور طبيعي روده براي سلامتي ماهي مي‌باشند(Karunasagar et al., 1993). استرس هم به عنوان عاملي که در شيوع بيماري ناشي از آئروموناس نقش دارد مورد توجه قرار مي‌گيرد. آئروموناس هيدروفيلا بيشتر در آبهايي با سطح مواد آلي بالا نسبت به آبهاي نسبتاً غير آلوده حضور دارد(Jeney & Jeney, 1995). واکسيناسيون براي جلوگيري از رشد آئروموناس ها انجام مي‌گردد که هنوز نوع تجاري آن در دسترس نيست. آئروموناس هيدروفيلا يک گونه هتروژنوس است و آنتي ژن هاي متغيري دارد از اين رو استفاده از واکسن جهت مقابله با آن فوق العاده پيچيده است(Yin et al., 2009).
در اين مطالعه با توجه به اهميت استفاده از محرک هاي ايمني با منشاء گياهي در ماهي و همچنين بومي بودن دو گياه لعل کوهستان و مرزه خوزستان در استان خوزستان، نقش تحريک ايمني اختصاصي و غير اختصاصي عصاره اين دو گياه در ماهي کپور معمولي مورد ارزيابي قرار گرفت. همچنين اثر عصاره ها در افزايش مقاومت در برابر عفونت آئروموناسي نيز مورد بررسي قرار گرفت.
1- 1. معرفي ماهي کپور معمولي
1-1-1. طبقه‌بندي ماهي‌ کپور
خانواده Cyprinidae از بزرگترين خانواده ماهيان آب شيرين هستند كه حدود 210جنس را شامل مي‌شوند (Fish Base, 2008) اين خانواده به راسته Cypriniformes تعلق دارد كه بيش از دو سوم جنس و گونه هاي آن را تشكيل ميدهد.
شکل 1-1 ماهي کپور معمولي
Phylum: Chordata
Sub phylum:Vertebrata
Superclass: Osteichthyes
Class: Actinoptergii
Subclass: Neopterygii
Infraclass: Teleostei
Superorder: Ostariophysi
Order: Cypriniforms
Family: Cyprinidae
Genus: Cyprinus
Species: Cyprinus carpio(Linnaeus,1758)
1-1-2. برخي ويژگي هاي خانواده کپور ماهيان2
اعضاي اين خانواده را مي‌توان براساس داشتن دندان حلقي (يک تا سه رديف، اما هرگز تعداد آنها در هر رديف از هشت عدد تجاوز نمي‌کند) و لب‌هاي نازک (معمولاً در مرز آروارة فوقاني تنها استخوان پيش فکي ديده مي‌شود) تشخيص داد. اگر چه بيشتر آنها تنها داراي شعاع‌هاي نرم در باله‌هاي خود هستند اما شعاع‌هايي که تغيير شکل‌يافته و به خار تبديل شده‌اند، در بعضي از اشکال وجود دارد که جالب توجه‌ترين آنها کپور معمولي و ماهي طلايي3 هستند.
اين ماهي‌ها بطور مشخص از حيوانات ريز(حيوانات کف زي و ساحلي) تغذيه مي‌کنند ولي بدواً پلانکتونها و گياهان جزء غذاي اين دسته از ماهيان مي‌باشند(پيغان و همکاران، 1384).
1-1-3. خصوصيات کپور معمولي
يکي از مهم‌ترين ماهيان پرورشي ايران است که پراکنش آن در حوضه‌هاي درياي خزر، رودخانه تجن و تمام حوضه‌هاي آبريز ايران بوده و عمدتاً دراستان‌هاي خوزستان، گيلان و مازندران پرورش داده مي‌شود. داراي دندان حلقي سه رديفي(1و2و3-3و2و1)، حداکثر طول بدن 150 (ميانگين 38) سانتي‌متر است، بدن اين ماهي کشيده و طول آن سه برابر ارتفاع مي‌باشد، سطح بدن از فلس‌هاي درشت پوشيده شده است، سر ماهي بزرگ و پوزه کند است باله پشتي خيلي طويل و باله مخرجي کوتاه است درباله پشتي 3 تا 4 خار سخت و 15 (16) تا 21 (22) شعاع نرم و شاخه‌شاخه دارد. در باله مخرجي نيز سه خار سخت و 5 يا 6شعاع نرم شاخه‌شاخه ديده مي‌شود. دو زوج سبيلک دارد و زوجي که بر روي آرواره پايين قرار دارد طويل‌تر است. همه چيزخوار است و از موجودات ريز بستر آب، کرم‌ها، سخت‌پوستان، نوزاد حشرات و حتي فضولات حيواني و گياهي، لاشه حيوانات، تخم ماهيان و نوزادان خود تغذيه مي‌کند (فرخ‌فر، 1387).
1-1-4. ارزش اقتصادي ماهي کپور معمولي
ماهي کپور معمولي يکي از مهمترين ماهيان پرورشي بشمار مي‌رود و توليد سالانه آن در جهان در سال 2006 از حدود 5/3 ميليون تن بالغ مي‌گردد. پرورش ماهي کپور به علت صرفه اقتصادي و گوشت خوشمزه آن در اغلب کشور ها از اهميت ويژه اي برخوردار است (وثوقي و مستجير، 1381FAO, 2010; ).
شکل 1-2 تولید جهانی آبزی پروری برای ماهی کپور معمولی
1-2. سيستم ايمني
1-2-1. استرس در ماهيان
شرايط استرس زا موجب بروز يك سلسله وقايع به هم پيوسته مي‌شود كه با تاثير بر سيستم هاي عصبي و آنزيمي و اختلال در اعمال فيزيولوژيك، زمينه بروز بيماري در ماهي را فراهم مي‌آورد. از جمله پاسخ هاي فيزيولوژيك عمده ماهيان به شرايط استرس زا، مي‌توان به ترشح هورمون هاي كاتكولامين و كورتيزول و استروئيد هاي غده فوق كليه اشاره كرد. اين هورمون ها بطور مستقيم و غير مستقيم از پاسخ هاي ثانوي يا ثالثي منتج مي‌شوند كه مي‌توان آنها را به انواع پاسخ هاي دخيل در تبادلات انرژي و سوخت ساز موثر در توازن عناصر و عملكردهاي فيزيولوژيك موثر در مقاومت عليه بيماري ها طبقه بندي كرد(سلطاني، 1387). کپور ماهيان با وجود مقاومت نسبتاً بالا مي‌توانند تحت استرس هاي محيطي و همچنين عوامل بيماري زا قرار گرفته و لذا نياز به محرک هاي ايمني و تقويت مکانسيم دفاعي بدن جهت پرورش بهينه دارد.
1-2-2. سيستم ايمني در ماهي
ايمني يک مکانيسم مهم فيزيولوژيک در حيوانات براي محافظت آنها در مقابل استرس، بيماريها و تنظيم محيط داخلي بدن ميباشد. ايمني ميتواند غيراختصاصي( مکانيسم دفاع ذاتي ميزبان در مقابل بيماري) بوده و يا اختصاصي (فرآيند اختصاصي در پاسخ به عوامل خارجي خاص) باشد. ايمني اختصاصي شامل پاسخ ايمني هومورال (توليد ايمونوگلوبولين) و سلولي (پس زدن پيوند و ازدياد حساسيت تأخيري) مي‌باشد(Iwama et al., 1996; Magnadottir, 2006).
واکنش هاي ايمني در آبزيان به علت قرار گرفتن آنها در ردههاي پايين تکامل جانوري، بيشتر وابسته به ايمني غيراختصاصي (ذاتي يا طبيعي) ميباشند. بطورکلي سيستم ايمني ماهي تکامل کمي يافته و اطلاعات در مورد آن نيز محدود است. هنگام مواجهه با عوامل بيماريزا، ايمني غيراختصاصي وظيفه محافظت اوليه ماهي و رهايي از عامل بيماريزا را به عهده دارد. در سالهاي اخير بعلت افزايش سرمايه گذاري در صنعت آبزي پروري، مطالعات بر روي سيستم ايمني آبزيان نيز توسعه قابل توجهي يافته است. با اين حال هنوز در مقايسه با حيوانات خونگرم اطلاعات بسيار محدودي از مکانيسم هاي دفاع ايمني در ماهيها و ديگر حيوانات خونسرد در دست است(عليشاهي، 1388). از اينرو و براي روشن شدن برخي تفاوت هاي اساسي سيستم ايمني ماهيها با حيوانات خونگرم و بويژه با انسان در ادامه به چند ويژگي سيستم ايمني ماهي ها اشاره مي‌نماييم.
1-2-2-1. ويژگي سيستم ايمني ماهيان
1-2-2-1-1. مکانيسم هاي دفاع غير لنفوئيدي
در ماهي مکانيسم هاي دفاع مختلفي در ايمني غير اختصاصي وجود دارد که شامل دو مورد زير است:
• سد دفاعي بافتهاي پوششي
• مولکولهاي دفاع غير اختصاصي هومورال
1-2-2-1-2. سد دفاعي بافتهاي پوششي ماهي
اولين خط دفاعي ماهي در برابر عوامل مهاجم ساختارهايي هستند که سدهاي فيزيکي يا شيميايي در مقابل هجوم اين عوامل ايجاد مينمايند. اپيتليوم پوست و آبشش مثالهايي از اين موانع ميباشند. اپيتليوم طبيعي توسط لايه موکوسي که توسط سلولهاي گلابي شکل ترشح ميشوند، پوشيده ميشود. لايه موکوسي (گليکوپروتئين ها، پروتئوگليکان ها و پروتئينها) تشکيل يک لايه، بين بدن ماهي و محيط خارجي ميدهد. مهمترين عمل موکوس ممانعت از چسبيدن و تثبيت باکتري ها، قارچ ها و انگلها به سطوح اپيتليالي ميباشد. ميزان ترشح موکوس ممکن است در پاسخ به عفونت يا محرکهاي فيزيکي و شيميايي افزايش يابد. فاکتورهاي ضدميکروبي مثل لايزوزيم و باکتريوليزين در موکوس پوست ماهي وجود دارند. کمپلمان نيز به عنوان يکي از سيستمهاي ضدميکروبي مهم در موکوس پوست مورد توجه واقع شده است. بر خلاف موجودات خونگرم پوست ماهي فاقد لايه مرده شاخي مي‌باشد(Iwama et al., 1996; Magnadottir, 2006).

1-2-2-1-3. مولکولهاي دفاع غيراختصاصي هومورال
سرم، موکوس و تخم ماهي، حاوي مواد مختلفي است که به صورت غيراختصاصي باعث ممانعت رشد ميکروارگانيسمهاي بيماريزا ميشوند. اين مواد اغلب پروتئين يا گليکوپروتئين بوده، بسياري از آنها همتا و معادلي در خون و همولنف بيمهرگان دارند.
بسياري از اجزاي سرم در شرايط مختلف واکنش هاي متنوعي را در برابر آنتي ژن ها نشان ميدهند. وقتي ماهي در معرض آنتيژني قرار مي‌گيرد، بسياري از اجزاي سرم به همراه ايمونوگلوبولينها، با آن واکنش مي‌دهند. سرم نرمال حيوانات حاوي انواعي از مولکولها ميباشد که با آنتيژنها بصورت غير اختصاصي وارد واکنش شده و واکنش ايجاد شده جدا از واکنش پادتن ها باآنتي ژن است. اين اجزاي ايمني هومورال شامل، پروتئينهاي فاز حاد، لايزوزيم، اينترفرون، کمپلمان، پروپردين، ليزين، آگلوتينين، لکتين، تريپسين، سايتوکين، پرسيپيتين4، پروتئين باند شده با يونهاي فلزي5 و بازدارندههاي پروتئيناز6 و ايکوزانوئيدها ميباشند. در بين موارد فوق به دو مورد لايزوزيم و کمپلمان که در آبزيان تفاوت بيشتري با حيوانات خونگرم دارند اشاره مي‌کنيم(Swain et al., 2006).
1-2-2-1-4. لايزوزيم
لايزوزيم که قبلاً به عنوان موراميداز يا اِن – استيل موراميد گليکانوهيدرولاز معروف بوده است، يک آنزيم موکوليتيک با منشاء لکوسيتي است که خاصيت دفاعي در برابر تهاجم ميکروبها دارد. اين آنزيم به طور وسيعي در طبيعت گسترش داشته و در ترشحات مختلف حيوانات مثل موکوس، بزاق و بسياري از بافتها مثل خون و نيز در واکوئلهاي سلولهاي گياهي يافت مي‌گردد. لايزوزيم باعث شکسته شدن پيوند (4-1)بتا، بين ان- استيل موراميک اسيد و ان – استيل گلوکوزامين در ديواره سلولي (لايه پپتيدوگليکان) باکتريهاي گرم مثبت گرديده، بدين وسيله از تهاجم اين باکتريها ممانعت بعمل مي‌آورد(Tribst et al., 2008).
باکتريهاي گرم منفي مستقيما توسط لايزوزيم آسيب نمي‌بينند؛ هرگاه ديواره سلولي باکتريهاي گرم منفي در اثر عملکرد کمپلمان، تخريب گردد و آنزيمهاي ديگر به لايه پپتيدوگليکان باکتري دسترسي يابند، لايزوزيم نيز بعلت دسترسي به پپتيدوگليکان غشاء، به طور موثري، فعاليت مي‌نمايد. علاوه بر عملکرد ضد باکتريايي، اين آنزيم باعث افزايش بيگانه خواري توسط سلولهاي بيگانه خوار، به صورت مستقيم و يا غير مستقيم( بوسيله اثر اپسونين ها)، مي‌گردد(Wang & Zhang, 2010).
اين آنزيم همچنين به ساختارهاي حاوي موراميک اسيد حمله کرده و گليکوکيتين را هيدروليز مي‌نمايد. لايزوزيم اثر تخريبي محدودي نيز روي کيتين (يک پليمر خطي از ان- استيلگلوکوزامين) که جزء مهمي از ديواره سلولي قارچها و اسکلت خارجي بعضي بيمهرگان است دارد. حداکثر فعاليت لايزوزيم در pH حدود 6-7مي‌باشد. نقطه ايزوالکتريک آن بين pH 10/5-11 و وزن مولکولي آن حدود14/400 دالتون ميباشد. فعاليت بالاي اين آنزيم در برابر ميکروکوکوس ليزودايکتيکوس7 در بافتهاي لمفوئيدي الاسموبرانشها و پلاسماي ماهيان استخواني يافت شده است. البته فعاليت اين آنزيم در طحال کمتر است. توليد لايزوزيم در ماهي، همانند پستانداران به طور عمده در نوتروفيلها، منوسيتها و مقدار کمتري در ماکروفاژها انجام ميگيرد(Magnadottir, 2006). لايزوزيم داراي خصوصيات زير مي‌باشد:
– سلول ميکروکوکوس ليزودايکتيکوس را ليز نمايد.
– توسط سلولز پوشيده شده با کيتين جذب گردد.
– پروتئيني با وزن مولکولي پايين باشد.
– در pH اسيدي و دماهاي بالا پايدار بوده و در شرايط قليايي غيرفعال گردد.
چون اطلاعات اوليه در مورد لايزوزيم پرندگان حاصل گرديده است، خانواده اين آنزيم کلاسيک به تيپ 8C(تيپ مرغي) معروف گرديده است. بافتهاي غني از لايزوزيم ماهي شامل کليه قدامي، پوست، آبششها، لوله گوارش و تخم ميباشند. افزايش همزمان لايزوزيم سرم با افزايش تعداد نوتروفيلها و منوسيتهاي موجود در گردش خون گوياي ترشح لايزوزيم توسط اين سلولها ميباشد. دو نوع لايزوزيم (تيپ 1 و تيپ 2) که از کليه ماهي قزلآلاي رنگينکمان جداسازي گرديده است، فعاليت ضدباکتريايي دارند. تيپ 1 لايزوزيم قزل آلا در برابر 7 باکتري گرم منفي مؤثر مي‌باشد، در صورتيکه لايزوزيم سفيده تخممرغ استاندارد فقط در برابر برخي باکتريهاي غيربيماريزا مؤثر مي‌باشد. لايزوزيم ماهي خاصيت ضدباکتريايي طبيعي بيشتري در مقايسه با لايزوزيم پستانداران دارد، و نه تنها در برابر باکتريهاي گرم مثبت بلکه در برابر باکتريهاي گرم منفي (در فقدان کمپلمان) نيز مؤثر است. فصل، جنسيت، بلوغ جنسي، دماي آب، استرس و عفونت، سطح لايزوزيم سرم ماهيها را تحت تأثير قرار ميدهند. سطح لايزوزيم سرم ماهي در فصل تابستان بالاتر از زمستان بوده که ميتواند به علت پيشگيري از عفونتهاي آئروموناسي باشد. به همين صورت نرها و مولدين در حال تخمريزي بالاترين فعاليت لايزوزيم را دارند(عليشاهي، 1388).
ايمنسازي ماهي با آنتيژنها، باعث افزايش تيتر آنتيبادي و لايزوزيم ميگردد، تيتر آنتيبادي و فعاليت لايزوزيم نسبت مستقيمي با هم دارند. چنين افزايشي در سطح آنزيم ميتواند تحت تأثير افزايش جمعيت گلبولهاي سفيد در طي تکوين پاسخ ايمني باشد؛ بنابراين عفونت باعث افزايش تعداد لوکوسيتها شده و ميتواند لايزوزيم سرم را افزايش دهد، از اينرو ميزان لايزوزيم سرم ميتواند ارزش تشخيصي براي تعيين وضعيت بيماري در ماهي داشته باشد(Iwama et al., 1996; Magnadottir, 2006).
1-2-2-1-5.کمپلمان
کمپلمان يک فاکتور هومورال ايمني ذاتي بوده و نقش مهمي در حفظ کارايي سيستم ايمني و حذف عوامل بيماريزاي مهاجم ماهي دارد. کمپلمان بيش از 20جزء دارد که برخي از اجزاي کمپلمان در ماهي هنوز گزارش نشده است. ولي شباهتهاي زيادي بين سيستم کمپلمان در ماهي و حيوانات خونگرم وجود دارد. فعالسازي کمپلمان از طريق يکي از مسيرهاي سهگانه زير انجام ميگيرد.
• مسير کلاسيک وابسته به آنتيبادي9 (CCP)
• مسير آلترناتيو مستقل از آنتيبادي (ACP)
• مسير لکتين10
در ماهيان استخواني حضور هر سه مسير تاييد شده است ولي نکته جالب اينجاست که در ماهيها فعال سازي کمپلمان از طريق مسير آلترناتيو بسيار بيشتر از مسير کلاسيک انجام مي‌گردد. به عبارت ديگر فعاليت کمپلمان در ماهي کمتر تحت تاثير واکنش مستقيم بين آنتي ژن و آنتي بادي است و به همين خاطر هر چند توليد پادتن در ماهي کمتر از حيوانات خونگرم انجام مي‌گيرد ولي فعاليت کمپلمان بيشتر از حيوانات خونگرم است. بطور کل سيستم ايمني اختصاصي در ماهي ضعيف بوده و بيشتر بار دفاعي بدن در ماهي بعهده سيستم دفاع غير اختصاصي است(Boshra et al., 2006).
1- 3. محرک هاي ايمني در آبزيان
جدول1- 1 تقسيم بندي محرک هاي ايمني در آبزيان (; Sakai,1999عليشاهي، 1383)
نوع مادهنمونه محرک ايمني در آبزيانمواد شيميايي ساختگيلواميزولFK-565 حاصل از محيط کشت ساکاروميسزموراميل دي پپتيد MDPمشتقات باکترياييبتا گلوکانپپتيدوگليکان Brevibacterium lactofermentum، گونه هاي ويبريوEF230ليپوپلي ساکاريد باکتريهاي گرم منفيادجوان کامل فروندسلول باکتري ويبريو آنگوايلاروم (واکسن ويبريو)پلي ساکاريدهاکيتينکيتوزانلنتينانLentinanشيزوفيلان Schizophyllanعصاره هاي گياهي و حيوانيعصاره تونيکت Ete(Tunicate)عصاره آبالون (Abalone) HdeFire fly squidQuillaja saponin (soap tree)عصاره سير Garlic extractادجوان ناقص فروندافزودني هاي غذاييويتامين C و ويتامين Eبرخي مواد معدنيهورمونها، سايتوکاين ها و مواد ديگرهورمون رشد، لاکتوفرين، پرولاکتيناينترفرون ها
مواد محرك ايمني مقاومت در برابر بيماريهاي عفوني را با تقويت سيستم ايمني غير اختصاصي ماهي افزايش مي‌دهند. پس حافظه ايمني در چنين مواردي بسيار كوتاه بوده و مدت کوتاهي بعد از قطع مصرف، اثر آن از بين مي‌رود. تحقيقات در مورد محركهاي ايمني ماهي در حال رشد روز افزون بوده و مواد بسياري با اين عنوان به صنعت آبزي پروري معرفي شده‌اند. استفاده از محركهاي ايمني بعنوان جايگزين يا تقويت کننده داروهاي شيميائي و واكسنها شديداً توسط آبزي پروران مورد توجه واقع شده است.
محرکهاي ايمني در تقويت ايمني غير اختصاصي بطور کلي نقش ايفا مي‌نمايند. بدين معني که بازوي غير اختصاصي دفاع ايمني در تمامي جهات از مرحله تشخيص و شناسايي آنتي ژن تا مراحل فاگوسيتوز و حذف آنتي ژن مورد نظر تقويت مي‌گردد. اما اين افزايش قدرت مقابله، اختصاص به آنتي ژن خاصي ندارد و حتي سيستم ايمني در برابر شرايط نامساعد محيطي نيز تقويت مي‌گردد. بطوريکه اثبات شده است که استفاده از محرک هاي ايمني قدرت مقابله ماهي در برابر استرس هاي محيطي مانند دما، شوري، حمل ونقل، کمبود اکسيژن و استرس هاي تغذيه اي را نيز افزايش مي‌دهد(Sakai, 1999).
در بين محرک هاي ايمني انواع مشتق شده از گياهان و حيوانات از نظر زيست محيطي جايگاه مناسب تري دارند. بخصوص اخيراً با پيشرفت در زمينه گياهان دارويي بسياري از گياهان با اثرات درماني به فارماکوپه کشورها معرفي شده اند. در کشور ما نيز اخيراً داروهاي با منشاء گياهي در درمان بيماريهاي انساني و دامي کاربرد يافته اند. از آنجا که صنعت آبزي پروري در کشور ما صنعتي جوان است، تا بحال بررسي در مورد نقش امکان استفاده از گياهان دارويي در آبزيان خيلي مورد توجه واقع نشده است(Iwama et al., 1996; Sakai, 1999 ;عليشاهي، 1383).

1-4. عصاره هاي گياهي
1-4-1. گياهان دارويي و ارزش آنها
طي ساليان متمادي داروهاي طبيعي، خصوصاً گياهان دارويي تنها طريق درمان محسوب مي‌شد و در عين حال مواد اوليه موجود در آنها در صنعت داروسازي مورد استفاده قرار مي‌گرفت. بهم خوردن توازن جمعيت و احتياجات از يک طرف و نا هماهنگي عرضه، تقاضا و گراني از طرف ديگر موجب شد که بشر به اين فکر بيفتد که آيا مي‌تواند ازمنشا ديگري دارو وترکيبات مورد نياز خود را تهيه کند بر اين اساس شروع به ساخت ترکيبات شيميايي نمود. با گذشت زمان بر تعداد گياهان دارويي شناخته شده افزوده شده و زمينه هاي کاربرد آنها نيز گسترده تر شد.کشف گياهان جديد از بين نمونه هاي آورده شده از سرزمينهاي دور، دستيابي به کاربرد هاي جديد بعنوان داروهاي کمکي در درمانهاي شيميايي يا آنتي بيوتيکي، پي بردن به ارزش بهداشتي گياهان و بالاخره کشف مواد جديدي نظير ويتامين ها، هورمونها، مواد ضد ميکروبي، ضد ويروسي، ضد توموري در ميان گياهان شناخته شده و يا گياهاني که به تازگي کشف شده اند، کمک شاياني در پيشرفت طب کردند(قاسمی دهکردی و طالب، 1380).
در چند دهه اخير استفاده از گياهان دارويي با توجه به مزيت هاي متعدد، ازجمله خطرات جانبي کمتر بر موجود زنده و محيط زيست، عدم ايجاد مقاومت دارويي، ارزان، پايدار و در دسترس بودن، توجهات زيادي را در سطح جهان بويژه کشورهاي پيشرفته به خود جلب نموده است(رجحان، 1387)، از اين رو در بين آنها، محرکهاي ايمني با منشاء گياهي داراي ارجحيت مي‌باشد.(Iwama et al., 1996)
1-4-2. گياهان مورد استفاده در تحقيق حاضر
1-4-2-1. مرزه خوزستان Satureja khuzestanica
يك گونه بومي بوده كه به طور گسترده در جنوب ايران پراكنده شده است و استفاده هاي دارويي دارد. جنس Satureja به خانواده Lamiaceae، زير خانواده Nepetoideae تعلق دارد. يكي از ويژگيهاي زير خانواده Nepetoideae آن است كه نمونه هاي آن داراي بيش از 5/0% روغنهاي ضروري مي‌باشند. گزارش شده است كه تفاوتهاي مشخصي در بين زير گونه هاي Satureja از لحاظ تركيبات روغنهاي ضروري وجود دارد. در طول سالهاي اخير اثرات ضد ويروسي، ضد التهاب، ضد باكتريايي، ضد قارچي، ضد تشنج، ضد اسهال و … براي زير گونه هاي مختلف Satureja كه در قسمتهاي مختلف جهان مي‌رويند گزارش شده است ولي مطالعات كمي در مورد روغنهاي ضروري اين گونهSKEO))11 انجام شده است(Haeri et al., 2006).
Oliveria decumbens vent1-4-2-2. لعل كوهستان
از جمله گياهان بومي ايران، مي‌توان به گياه لعل کوهستان اشاره نمود كه گياهي بوته اي و متعلق به خانواده چتريان (Umbelliferae) مي‌باشد. در ايران يک گونه به نام O.decumbens وجود دارد که به زبان محلي به آن “دن”، “دنک” و “موشکورک” مي‌گويند و در مناطق گرمسيري استانهاي خوزستان، ايلام و کرمانشاه مي‌رويد. مردم اين مناطق به طور گسترده اي از قسمتهاي هوايي اين گياه در درمان بيماريهاي عفوني استفاده مي‌كنند. اين گياه علاوه بر ايران در جنوب شرق تركيه، سوريه و عراق نيز پراكنده است(مظفريان، 1382). مطالعات مختلفي روي ترکيب شيميايي اسانس حاصل از گلهاي اين گياه انجام گرفته است(Amin et al., 2005; Sajadi & Hosseini, 2002; نجف پور نوايي و ميرزا، 1381).
تا کنون دو مطالعه روي خاصيت ضد ميکروبي آن انجام شده است; Amin et al., 2005)محبوبي و همکاران، 1381). بازده اسانس استخراج شده از اين گياه در مناطق مختلف ايران متفاوت بوده بطوريکه در شيراز 6% و در کرمانشاه 1/0% گزارش شده که شامل ترکيبات: تيمول، کارواکرول، گاما-تريپنن و پاراسيمن مي‌باشد
(Sajadi & Hosseini, 2002; Amin et al, 2005).
اسانس حاصل از اندام هوايي گياه لعل کوهستان به رنگ زرد و داراي بويي نافذ شبيه به بوي اسانس آويشن مي‌باشد. اثرات مختلف دارويي عصاره و اسانس اين گياه بيشتر به کارواکرول و تيمول موجود اين محصولات وابسته است. اثر ضد باکتريايي اين ماده بيشتر به تغيير نفوذپذيري غشاي سلولي باکتري است ولي نقش آن در تحريک ايمني به خوبي مشخص نشده است(1999 ,., 1999; Ultee et al.Cosentino et al).
بطور کلي ميکروارگانيسم ها بسته به اينکه چه ساختاري دارند، از نظر مقاوت يا حساسيت نسبت به يک اسانس خاص و يا اجزاي آن با يکديگر تفاوت دارند. باکتري هاي اسپوردار نسبت به سلولهاي رويشي و باکتري هاي گرم منفي نسبت به باکتري هاي گرم مثبت نسبت به اسانس لعل کوهستان مقاوم ترند. اسانس لعل کوهستان برروي تعدادي از ميکروارگانيسم ها اثر مهاري و تعدادي ديگر، اثر باکتري کشي دارد(محبوبي و همکاران، 1387).
1-4-3. مواد موثره گياهان دارويي مورد استفاده (بيوشيمي گياهان)
مقدار ماده موثره در هر گياه ناچيز بوده و کمتر از 1% وزن خشک آن است. نوع و مقدار مواد موثره به گونه گياه بستگي دارد. تاثير آب و هوا و اقليم بر ميزان مواد موثره به اثبات رسيده است(عطايي عظيمي و همکاران، 1385).
بطور کلي در گياهان دو گروه از مواد ساخته مي‌شوند که شامل فرآورده ها ي اوليه و ثانويه مي‌باشد. فرآورده هاي اوليه در همه گياهان وجود داشته و براي زندگي گياه ضروري مي‌باشند و فرآورده هاي ثانويه حاصل فرآيند هاي جانبي و حاشيه اي در گياهان بوده و براي زندگي گياه ضروري نيستنند.40% داروهاي دنيا از گياهان ساخته مي‌شوند.
1-4-4. استخراج ترکيبات شيميايي موجود در گياه
الف. جمع آوري گياه: جمع آوري انواع گياهان يک منطقه نيازمند شناخت محل مورد نظر است و بايد توسط افراد مجرب و ترجيحا” گياه شناس انجام شود. بي توجهي و عدم دقت در جمع آوري ممکن است سبب آلودگي گياه مورد نظر باگياهان ديگر شود(ذکاء، 1364).
ب. خشک کردن: گياهان جمع آوري شده بايد در محلي مناسب و دور از نور خورشيد خشک شده كه باعث خارج شدن مقدار زيادي رطوبت آنها و با عث وقفه اثر آنزيمها، تغييرات شيميايي، رشد ميکروبي و قارچي گرديده و گياه تا مدتها قابل نگهداري خواهد بود(مجتبايي و سمسار، 1347).
ج. آسياب کردن: پودر گياه توسط آسياب الکتريکي تهيه شده و بايد در مورد همه گياهان از يک نوع صافي استفاد شود تا پودر يکسان و يک اندازه بدست آمده و آنرا را در کيسه هاي نايلوني جمع آوري مي‌كنند(ذکاء، 1364).
د. استخراج مواد موثره: مهم ترين و اساسي ترين عاملي که بايد در استخراج مواد متشکله گياهان مورد توجه قرار گيرد حلال است که انتخاب آن با توجه به اندام مورد نظر گياه و ماده مورد استخراج صورت مي‌گيرد(سپه وند، 1387).
1-4-5. روش هاي استخراج عصاره هاي گياهي
1. روش خيساندن: اين روش قديمي است که بوسيله آب يا حلال هاي مختلفي صورت مي‌گيرد. در اين روش گياه مورد نظر را ابتدا به صورت گرد در آورده و در يک فلاسک ريخته و مدت 2 تا 4 روز ( بر حسب نوع گياه) در محلي مناسب قرار داده و سپس صاف مي‌نمايند. عمل خيساندن معمولاً براي آن دسته از دارو هايي بکار مي‌رود که ساختمان سلولي کاملي نداشته و يا فاقد ساختمان سلولي مي‌باشند.اين كار معمولا” در حرارت تا 20 درجه سانتي گراد انجام مي‌گيرد(صمصام، 1371 ).
2. روش پرکولاسيون: در اين روش بافت هاي گياهي مورد نظر را بصورت پودر در آورده و در ظرفي بنام پرکولاتور ريخته و عمل عصاره گيري را انجام مي‌دهند(صمصام، 1371).
3. روش هضم: در اين روش همان روش خيساندن به اضافه کمي حرارت (40 تا 50 درجه سانتي گراد ) مي‌باشد زماني استفاده مي‌شود که اولا” حرارت باعث خراب شدن مواد نشود، ثانيا” حرارت مداوم استخراج مواد را زياد نمايند(سپه وند، 1387).
4. دم کردن: امروزه دم کردن كاربرد چنداني ندارد. در اين روش حلال مورد استفاده آب بوده و مشکل اصلي اين روش هجوم باکتري ها و قارچ ها مي‌باشد که باعث آلوده شدن عصاره و در نتيجه تغيير مواد متشکله گياه مي‌گردد(صمصام، 1371).
5. جوشاندن: اين روش نيز مانند دم کردن موارد استعمال چنداني در زمينه استخراج مواد متشکله گياهان دارويي ندارد(سپه وند، 1387).
6. عصاره الکلي: اکثر مواد موثر در گياهان دارويي در الکل حل مي‌شوند بخشهاي خشک يا تازه گياه را براي استخراج مواد موثر در الکل غوطه ور كرده كه مواد استخراج شده با الکل از دو روش ديگر سالم تر است. با الکل مي‌توان غلظتهاي بالايي ازمواد موثره گياه را استخراج و براي حدود يک سال نگه داشت(عطايي عظيمي و همکاران، 1385).
1-5. پارامترهاي خون شناسي
1-5-1. عناصر سلولي خون ماهيان
ماهيان برخلاف دوزيستان و مهره داران عالي تر مانند پستانداران در حفرات مياني استخوان هايشان بافت خونساز وجود ندارد. عمل خونسازي در ماهيان استخواني عالي(تلئوست) بطور عمده در کليه و طحال صورت مي‌گيرد. بافت خونساز، در قسمت قدامي کليه و در بافت همبند سراسر آن، به همراه بافت لنفوئيدي قرار دارد. سلول هاي بافت خونساز در مراحل مختلف بلوغ ديده مي‌شوند و پيش ساز سلول هاي خوني مي‌باشند و در مراحل مختلف رشد قابل مشاهده مي‌با شند(Amin, 1992). عناصر سلولي موجود در خون ماهيان در گونه هاي مختلف متفاوت مي‌باشد و شامل اريتروسيت‌ها12، لنفوسيت ها13، مونوسيت ها14، نوتروفيل ها15، هتروفيل ها16، بازوفيل ها17، ائوزينوفيل ها18، ترومبوسيت ها 19و سلول هاي نابالغ مي‌شود و وظايفي همانند سلول هاي پستانداران بر عهده دارند. کليه و طحال بافت‌هاي خونساز ماهي را تشکيل مي‌دهند و همه سلول هاي خوني از اين دو ارگان منشاء مي‌گيرند. محل اوليه خونسازي معمولاً در کليه و محل ثانويه توليد آن طحال‌‌ مي‌باشد. اگرچه در برخي گونه ها ممکن است طحال محل اوليه خونسازي باشد. طحال همچنين محل توليد لنفوسيت ها نيز ميباشد. محل توليد ترومبوسيت ها، مونوسيت ها، نوتروفيل ها، ائوزينوفيل ها و بازوفيل در بخش قدامي کليه مي‌باشد.
1-5-1-1. گلبول هاي سفيد
تعداد گلبول هاي سفيد خون ماهي در هر ميلي متر مکعب خون در مقايسه با تعداد گلبول هاي قرمز خون ماهي در هر ميلي متر مکعب کمتر بوده و دفاع بدن در مقابل ميکروارگانيسم هاي بيماريزا را بر عهده دارند. شمارش کلي و تعيين درصد انواع گلبول هاي سفيد کمک مهمي در تشخيص حالات فيزيولوژيک و پاتولوژيک حيوان مي‌نمايد و انواع متعددي از گلبول هاي سفيد شامل لنفوسيت ها، مونوسيت ها، نوتروفيل ها (هتروفيل ها)، بازوفيل ها و ائوزينوفيل ها در خون ماهي يافت مي‌شود(ستاري، 1381).

1-5-1-1-1. لنفوسيت ها
بررسي ها حاکي از وجود گروههاي مختلف لنفوسيتي در ماهيان مي‌باشد، ولي اينکه آيا گروههاي مختلف لنفوسيت در اعضاي ديگري(برخلاف تيموس و مغز استخوان پستانداران) تمايز و رشد مي‌يابند نياز به بررسي هاي بيشتري دارد(رسولي و عبدلي, 1384). يافته هاي جديد نشان مي‌دهد که ماهيان استخواني داراي دو نوع لنفوسيت B و T در تيموس مي‌باشند.
شکل 1-4 لنفوسيت(*40)
1-5-1-1-2. نوتروفيل ها
نوتروفيل ها بيشترين گلبول هاي سفيد چند هسته اي ماهيها را(بجز چند استثناء مانند ماهي بادکنکي) تشکيل مي‌دهند(پوستي و صديق مروستي، 1378). سلول هاي نوتروفيل در ماهيان استخواني گرد تا کمي بيضي شکل با هسته غير مرکزي مي‌باشند. نوتروفيل هاي در ماهيان استخواني سيتوپلاسم فراوان بدون رنگ، مايل به خاکستري يا کمي اسيدوفيلي دارا بوده و ممکن است حاوي گرانول هاي کوچک سيتوپلاسمي باشند. اختلافات درون گونه اي نيز در واکنش هاي سيتوشيمي نوتروفيل هاي ماهيان استخواني مشاهده شده است(.(Thrall, 2004
شکل 1-5 نوتروفيل(*40)
1-5-1-1-3. ائوزينوفيل ها
در گسترش هاي خون ماهيان استخواني به ندرت ائوزينوفيل گزارش شده است. در ماهي طلايي20، استورژن سفيد21 و گربه ماهي روگاهي22 ائوزينوفيل‌ها گزارش گرديده است.(Thrall, 2004) ائوزينوفيل از نظر اندازه شبيه به نوتروفيل ها يا کمي کوچکتر مي‌باشندet al., 2000) (Feldman ائوزينوفيل هاي کپور تقريبا 5/7 ميکرومتر قطر دارند و داراي هسته غير مرکزي تو رفته، سوسيسي شکل يا دولوبه مي‌باشند.(Thrall, 2004) وظيفه ائوزينوفيل ها کشتن انگل و شرکت در فاگوسيتوز مي‌باشدet al., 2000) .(Feldman

شکل 1-6 ائوزينوفيل(*40)

1-5-1-1-4. بازوفيل هاي ماهيان استخواني
بازوفيل ها درخون محيطي ماهيان استخواني نادر و کمياب هستند و فقط در چند گونه گزارش گرديده‌اند(Thrall, 2004; Caod, 1991). در صورت مشاهده تعداد آنها خيلي کم بوده و در مجموع اطلاعات کمي در رابطه با وظايف و موفولوژي آنها در دست مي‌باشد.
شکل 1-7 بازوفيل(*40)
1-5-1-1-5. مونوسيت ها
در بيشتر گونه هاي ماهيان استخواني و غضروفي مونوسيت ها در خون محيطي گزارش شده و به مونوسيت هاي پرندگان و پستانداران شباهت دارند. هسته داراي اشکال مختلف کليه اي شکل تا لوبوله مي‌باشد و معمولاً کمتر از 50 درصد حجم سيتوپلاسم را اشغال مي‌کند((Thrall, 2004.
شکل 1-8 مونوسيت(*40)
1-6. آئروموناس ها (Aeromonas spp.)
باكتريهاي جنس آئروموناس در طبيعت، در داخل آب و خاك يافت مي‌شوند. بيشتر اين باكتريها ساپروفيت بوده و همه آنها مي‌توانند در طيف وسيعي از تغييرات درجه حرارت بدن ماهي رشد كنند. هنگامي كه دفاع بدن ماهيان كاهش مي‌يابد، اين موجودات، ميزبان آئروموناس مي‌شوند و مورد تهاجم اين باكتري قرار مي‌گيرند. نام «بيماري ناشي از آئرومونادهاي متحرك» در سال 1974، براي اين بيماري گزيده شد. با وجود اين كه اين موجودات، پاتوژن اجباري نيستند، ولي به عنوان عوامل بيماريزاي اصلي در بين ماهيان آب شيرين به حساب مي‌آيند(ستاري، 1378).
تعدادي از آئروماناس ها به دليل ايجاد مشکلاتي بزرگ در آبزي پروري کپور، مورد توجه هستند و اگر چه به عنوان عامل پاتوژن به شمار مي‌روند ولي آنها همچنين بعنوان قسمتي از ميکرو فلور طبيعي روده براي سلامتي ماهي مي‌باشند(Karunasagar et al., 1993). ثانياً استرس هم به عنوان عاملي که در شيوع بيماري ناشي از آئروموناس نقش دارد مورد توجه قرار مي‌گيرد. آئروموناس هيدروفيلا بيشتر در آبهايي با سطح مواد آلي بالا نسبت به آبهاي نسبتاً غير آلوده حضور دارد(Jeney & Jeney, 1995). واکسيناسيون براي جلوگيري از رد آئروموناس ها انجام مي‌گردد که هنوز نوع تجاري آن در دسترس نيست. آئروموناس هيدروفيلا يک گونه هتروژنوس است و آنتي ژن ها متغيري دارد از اين رو استفاده از واکسن فوق العاده پيچِيده است(Jeney & Anderson, 1993).
1-7. پيشينه و تاريخچه تحقيق
به دليل بومي بودن گياه مرزه خوزستان Satureja khuzestanica و گياه لعل کوهستان Oliveria decumbens تا کنون تحقيق و مطالعه اي درباره فرآورده هاي اين دوگياه بطور كلي در آبزيان در داخل و خارج از کشور انجام نشده است، لذا به بررسي مطالعاتي که اثرات اين دو گياه را بر ساير موجودات بررسي نموده اند، و يا اثر عصاره ساير گياهان را بر ماهي مورد مطالعه قرا داده اند، اشاره مي‌گردد.
1-7-1. تحقيقات انجام گرفته در ايران
مطالعات محدوي در داخل کشور برروي اثرات گياهان دارويي در صنعت آبزي پروري انجام شده است که از آن جمله مي‌توان به بررسي اثرات گياه اکاليپتوس Eucalyptus (سلطاني، 1387)، صبر زرد Aloe vera (Alishahi et al., 2010)، سرخارگل Echinacea purpurea ، سيليمارينSylibum marinum (عليشاهي، 1388) در ماهي کپور اشاره نمود.
قنواتي و همکاران در سال 1388 اثرات ايمني دو گياه سياه دانه Viscum album و دارواش Nigella sativa را برروي ماهي کپور معمولي بررسي کردند و نتايج حاصل نشان داد که عصاره گياه دارواش گزينه مناسبي براي تحريک ايمني ماهي کپور معمولي بوده ولي سياه دانه عليرغم گزارشات تحريک ايمني در حيوانات خونگرم، گزينه مناسبي براي تحريک ايمني غير اختصاصي در ماهي نيست.
Vosough-Ghanbari و همکاران در سال 2008 اثر Satureja khuzestanica را در بيماران ديابت نوع 2 مورد بررسي قرار دادند و استفاده از اين گياه را به عنوان مکمل با داروهاي ديابت نوع2 توصيه کردند.
Basiri و همکاران در سال 2007 اثرSatureja khuzestanica برروي موش مورد برسي قرارداده که نشان داد عصاره اين گياه که با مالاتيونين القاء شده در تحريک گليکوژنوليزيز سلول هاي کبدي و گلوکونئوژنسيس دخالت
مي‌کند و از طريق خاصيت آنتي اکسيداني فعاليت استيل کولينستراز را افزايش مي‌دهد.
محبوبي و همكارن در سال 1387 با مطالعه خاصيت ضد ميكروبي و تركيب شيميايي اسانس گياه لعل كوهستان بروي طيف وسيعي از ميکروارگانيسم ها, قارچهاي رشته اي و مخمرها به اين نتيجه رسيدند که باکتريهاي گرم مثبت و منفي نسبت به قارچها و باکتريهاي گرم منفي نسبت به باکتري هاي گرم مثبت مقاوم ترند.
Rezvanfar و همکاران در سال 2009 اثر Satureja khuzestanica برروي فاکتورهاي خوني موش مورد مطالعه قرار دادند و پس از بررسي بيماري کبدي، تاثير گياه را در حذف راديکال هاي آزاد مشاهده کردند.
1-7-2. تحقيقات انجام گرفته در خارج از كشور
Yin و همکاران در سال 2009 اثر گياهان چيني Astragulas radix و Ganoderma lucidum را بعنوان افزايش دهنده پاسخ هاي ايمني کپور معمولي ومقاومت در مقابل Aeromonas hydrophila بررسي نمودند. نتايج آنها نشان داد، تغذيه کپورهاي واکسينه شده و غير واکسينه شده با عصاره Astragula و Ganoderma فعاليت تنفس، فاگوسيتوز، ليزوزيم و آنتي بادي را در پلاسماي کپورهاي واکسينه شده تحريک مي‌کند از طرفي ماهياني که در معرض آئروموناس هيدروفيلا قرار گرفته بودند نيز درصد بقاي متفاوتي داشتند بهترين ميزان بقاء مربوط به گروهي از ماهيان واکسينه شده که با هر دو نوع گياه تغذيه شده بودند مي‌شد اين در حالي بود که 90% از ماهيان گروه کنترل و 60% از ماهياني که فقط واکسينه شده بودند مردند.
Choi و همکاران (2008) روي اثر گياه دارواش كره اي بصورت خوراکي بر فاکتورهاي ايمني و مقاومت در برابر بيماريها در گربه ماهي تحقيق نموده و برخي ويژگيهاي مناسب تحريک ايمني اين گياه در ماهي را گزارش نمودند. همچنين Karatas و همکاران(2003) نيز اثر عصاره اين گياه در ماهي قزل آلا را مورد بررسي قرار دادند و بهبود برخي فاکتورهاي ايمني را گزارش نمودند.
Rodrigues و همکاران در سال 2008 با ارزيابي اثر دوزهاي مختلف از Sulfated polysaccharide که از جلبکهاي قرمزدريايي Solieria filiformis استخراج شده بود بروي پست لارو ميگويLitopenaeus vannamei دريافتند پرورش پست لاروها در آب حاوي پلي ساکاريد سولفاته اثري برروي افزايش وزن و بقاء نداشت از طرف ديگر ميگوهاي که در معرض mg/lit1/0 از اين پلي ساکاريدها قرار مي‌گرفتند و در شرايط استرس از نظر سلامت وضعيت بهتري داشتند.
Umphanو Saengkrachang در سال 2008 با مطالعه برروي گربه ماهی (Pangasinidon gigas) که با پلت هاي مکمل شده با گونه Spirulina تغذيه شده بودند دريافتند که پلت هاي مکمل شده با گونه مذکور مي‌تواند رشد و عملکرد بلوغ مولدهاي اينگونه را بهبود ببخشد.
مطالعه اثر گياهان Astragalus membrances , Lonicera japonica و Boron برروي سيستم ايمني غير اختصاصی ماهي تيلاپيا Oreochromis niloticus و مقاومت در مقابل Aeromonas hydrophila توسط Ardo و همکاران در سال 2008 نشان داد که عصاره دو گياه و مکمل boron اضافه شده به غذاي پايه مي‌تواند به عنوان تحريک کننده سيستم ايمني عمل کند و پاسخهاي ايمني و مقاومت در مقابل بيماري هاي ماهيان پرورشي را افزايش دهد.
Yin و همکاران در سال 2006 با بررسي اثر دو گياه چيني Astragalus radix و Scutellaria radix برروي پاسخ هاي ايمني غير اختصاصي ماهي تيلاپياي Oreochromis niloticus دريافتند تفاوت معني داري در گروههاي تغذيه شده با دوزهاي مختلفي از دو گياه وجود نداشت و بهترين دوز از Astragalus radix 1/0% و 5/0% با يک دوره غذادهي سه هفته اي بود. آنها معتقد بودند تحقيقات بيشتري نياز است تا تحريک کنندگي و زمان مناسب تغذيه از Scutellaria radix مشخص شود.
Citarasu و همکاران در سال 2006 پنج نوع گياه دارويي بومي هند را از نظر افزايش مقاومت در برابر عفونت ها و تحريک سيستم ايمني ميگو مورد بررسي قرار دادند و تقريبا تمام گونه هاي مورد مطالعه درجاتي از افزايش مقاومت وتحريک سيستم ايمني ميگو را ايجاد نمودند.
Tan و Vanitha در سال 2004 اثرات ضد ميکروبي و نيز تنظيم کنندگي سيستم ايمني تعدادي از گياهان دارويي چيني سنتي صبر زرد Aloevera , Angelica species , Astragalus membrances ,Ganoderma lucidua , Panax ginseng , Scutellaria species , Zingiber officinulle را بررسي کردند که مشاهده نمودند هر کدام از اين گياهان در نهايت يکي از ترکيبات سلول هاي سيستم ايمني را تنظيم مي‌کند.
Marian و همکاران در سال2004 افزايش مقاومت نوعي ماهي هامور Epinephelus tauvina را در برابر ويبريو هارويي پس از تغذيه ماهي با غذاي غني شده با عصاره برخي گياهان دارويي داراي اثرات ضد باکتريايي و محرک ايمني، گزارش نمودند.
مطالعه اي که برروي اثرات داروهاي چيني سنتي برروي سيستم ايمني غير اختصاصي و مقاومت بيماري در گونه Croaker(Pseudosciaena crocea) در سال 2003 توسط Jian و Wu انجام شد نشان داد، که اين گياهان ممکن است افزايش عملکرد سيستم ايمني غير اختصاصي و مقاومت در مقابل بيماري را باعث شود.
Dujenci و همکاران در سال 2003 با بررسي اثر تعدادي از گياهان دارويي به عنوان تحريک کننده سيستم ايمني در ماهي قزل آلا به اين نتيجه رسيدند که عصاره گياهان اضافه شده به غذاي ماهي سطح پروتئين کل در پلاسما را افزايش مي‌دهد. به استثناي تيمار زنجبيل 1/0%، بيشترين سطح پروتئين پلاسما در گروههاي تغذيه شده با عصاره زنجبيل 1% مشاهده گرديد. گياهان مورد مطالعه در تحقيقات آنها شامل: Viscumalbam , Urticadioica , Zingiber officinale بود.
Harikrishnan و همکاران در سال 2003 با غوطه ور نمودن ماهي کپور معمولي درعصاره برگ گياه Azadirachta indica توانستند افزايش مقاومت به آئروموناس هيدروفيلا و کاهش علائم و تسريع در بهبودي زخمهاي ايجاد شده متعاقب عفونت باکتريايي را گزارش نمايند.
Jian و همکاران در سال 2004 اثرات برخي گياهان دارويي بومي چين Angelicae Sinensis وRadix astragalin Seu Hedysari را بر ماهي کپور معمولی بومي چين مورد بررسي قرار داده و تحريک سيستم ايمني غير اختصاصي ماهي تحت تاثير عصاره اين گياهان دارويي را گزارش نمودند.
Kim و همکاران در سال 1999 اثر غذاي مکمل شده با گياه صبر زرد Aloe بروي پاسخ هاي ايمني غير اختصاصي و مقاومت در مقابل بيماري Vibrio alginolyticus در ماهيان جوان سنگ ماهی Rock fishمورد مطالعه قرار دادند. غذاي مکمل شده با Aloe در فعاليت سرم ليزوزيم اثر معني داري نداشت. نتايج آنها نشان داد دوز متوسطي از غذا دهي با Aloe مي‌تواند به مقاومت در ماهيان جوان سنگ ماهی (Sebastes schlegel)Rock fish کمک نمايد.
اهداف تحقيق :
• بررسي اثر عصاره لعل کوهستان Oliveria decumbens و مرزه خوزستانSatureja khuzestanica بر فاکتورهاي ايمني ماهي كپور معمولي.
• مقايسه اثر عصاره لعل کوهستان Oliveria decumbens و مرزه خوزستانSatureja khuzestanica بر برخي فاکتورهاي ايمني و خون شناختي ماهي کپور معمولي.
• بررسي اثر عصاره لعل کوهستان Oliveria decumbens و مرزه خوزستانSatureja khuzestanica در افزايش مقاومت نسبت به عفونت ناشی از باكتري Aeromonas hidrophila در کپور معمولي.
فرضيات تحقيق :
• عصاره گياه لعل كوهستان (Oliveria decumbens) و عصاره گياه مرزه خوزستان (Satureja khuzestanica) داراي اثرات محرك ايمني در ماهي كپور معمولي مي‌باشند.
• عصاره گياه لعل كوهستان (Oliveria decumbens) و عصاره گياه مرزه خوزستان (Satureja khuzestanica) باعث افزايش مقاومت كپور معمولي در برابر باكتري بيماريزاي Aeromonase hydrophila مي‌شوند.
فصل دوم- مواد و روش ها
2-1. مراحل انجام تحقيق به ترتيب اولويت زماني به شرح زيرمي‌باشد
2-1-1. مکان و زمان انجام تحقيق
آزمايشات جهت بررسي اثرات محرک هاي ايمني(عصاره گياهان مرزه خوزستان Satureja khuzestanica و لعل کوهستان (Oliveria decumbens در آزمايشگاه بهداشت و بيماري هاي آبزيان در دانشکده دامپزشکي دانشگاه شهيد چمران اهواز انجام گرديد. براي انجام آزمايشات از 8 آکواريوم 350 ليتري(طول200، عرض 70 و ارتفاع 90 سانتی متر) مجهز به امکانات هوادهي مناسب استفاده شد. آزمايشات از ارديبهشت ماه سال 1389 و به مدت 5 هفته انجام گرفت.
2-1-2. شرايط فيزیکوشيميايي آب آکواريوم هاي آزمايش
ابتدا ضد عفوني و آماده سازي آکواريوم هاي آزمايش و سپس آبگيري آنها صورت گرفت. شرايط فيزيکوشيميايي آب آکواريوم ها در طول مدت آزمايش با تعويض حدوداً 10% حجم آب بصورت روزانه در حد مطلوب و مناسب حفظ گرديد. جهت حفظ کيفيت آب از بيوفيلتر اكسترنال مارك Athman در سيستم آبرساني استفاده و کليه آکواريوم ها مجهز به سيستم هوارساني بودند. پارامترهاي فيزيکي و شيميايي آب روزانه مورد بررسي و نوسانات آن در طول دوره آزمايش به ترتيب درجه حرارت: c˚1±25؛ اکسيژن محلول: ppm 10-8 ؛ pH :3/0±9/7 ثبت گرديد.
2-1-3. ماهيان آزمايش
تعداد 320 قطعه بچه ماهي کپور معمولي با وزن متوسط 3±30 گرم از مزرعه پرورش ماهي مرکز پرورش شوشتر خريداري و با استفاده از کپسول اکسيژن و مخازن مخصوص حمل ماهي به دانشکده دامپزشکي اهواز منتقل گرديد. ماهي ها از نظر بيماري هاي انگلي و باکتريايي مورد بررسي قرار گرفته و مدت يک هفته به منظور استاندارد سازی با شرايط در مخازن با غذاي پلت معمول ماهی کپور معمولی ساخت کارخانه بيضاء شيراز تغذيه گرديدند.
شكل 2-1 شرايط آزمايشگاهي ايجاد شده جهت سازگاري ماهيان آزمايش
2-1-4. تهيه عصاره ها گياهان آزمايش
200 گرم از اندام هاي هوايي دو گياه مرزه خوزستان(Satureja khuzestanica ) و لعل کوهستان(Oliveria decumbens) جمع آوري شده از اطراف اهواز در ارديبهشت ماه سال 1389 تهيه و به آزمايشگاه فارماکولوژي دانشکده دامپزشکي دانشگاه شهيد چمران اهواز منتقل گرديد. گونه هر دو گياه قبلاً به تاييد مرکز تحقيقات گياهان دارويي جهاد کشاورزي استان خوزستان رسيده بود. بعد از خشک نمودن گياه در شرايط تاريکي، هر دو گياه آسياب شده و پودر حاصل وزن گرديد. سپس 5 برابر وزن گياه الکل ( اتانول 96 درجه) به پودر حاصل اضافه شد. اين مخلوط در ارلن به مدت 3 روز در آزمايشگاه نگهداري گرديد. ماده حاصل بوسيله مگنت مغناطيسي کاملاً مخلوط گرديده و بوسيله کاغذ صافي واتمن(شماره 1، سايز چشمه 42 ميکرون) صاف گرديد. ابتدا از يک کاغذ صافي و در مرحله بعد از 2 کاغذ صافي استفاده شد. عصاره الکلي خام بدست آمده به قيف بوخنر انتقال داده شد تا صاف شود و تمام ذرات ريز آن گرفته شود سپس مايع بدست آمده در بالن تقطير گرديد تا الکل موجود در آن جدا شود. پس از تقطير عصاره گياهان مورد نظر در ارلن جمع آوري گرديد. براي افزايش غلظت عصاره آنرا در بشر ريخته و در بنماري 40 درجه سانتی گراد قرار داده تا الکل آن بيشتر تبخير گردد و غلظت عصاره به ميزان مورد نظر برسد(روش استاندارد تقطير الكل)(زرگري، 1384).
شکل 2-2 مراحل عصاره گيري گياه مرزه خوزستان و لعل كوهستان
2-1-5. تهيه جيره هاي آزمايش حاوي عصاره گياه
ميزان يک کيلوگرم غذای پلت ماهي کپور ساخته شده توسط شرکت بيضاء شيراز بر روي يک سيني گسترانيده و ميزان مورد نياز از هر عصاره براي ايجاد نسبت 5/0% ( نسبت ماده خشک عصاره به غذاي ماهي)، به روي غذا اسپري گرديد. اين عمل بعد از بهم زدن خوراک چندين بار تکرار شده و سپس بمدت 24 ساعت غذا در هواي آزاد قرار داده شد، تا کاملا خشک گردد. بعد از خشک شدن، غذا در کيسه هاي نايلوني بسته بندي، نام گذاري و تا زمان استفاده در يخچال و در 4 درجه سانتيگراد نگهداري گرديد(Alishahi et al., 2010).
جدول 2-1 آنالیز غذای کپور معمولی کارخانه بیضاء
مواد مغذیدرصدانرژی قابل هضم4000-3800پروتئين خام37-35چربی خام9-7فيبر خام5رطوبتکمتر از 10خاکسترکمتر از 10TVN(mg/100g)45
شکل 2-3 تهيه جيره ماهيان آزمايش و ترکيب آن با عصاره
2-2. تيمارهاي آزمايش تحقيق (Yin et al., 2009)
بعد از طي شدن مرحله سازش يابي (Adaptation)، ماهي هاي آزمايش بصورت کاملاً تصادفي بين 8 آکواريوم 350 ليتري توزيع گرديدند. تيمارهاي آزمايش شامل دو گروه ايمن و غير ايمن بودند كه تيمار هاي ايمن با استفاده از باکتري آئروموناس هيدروفيلا (باکتري غير فعال شده با فرمالين) به ميزان 100 ميکرو ليتر و تراکم 108 باکتري در ميلي ليتر به روش داخل صفاقی I.P23 تزريق گرديدند كه تزريق در روز 14 مجدداً تکرار گرديد. کليه تيمارها با جيره آزمايشي به مدت 5 هفته و به ميزان 4% وزن بدن ماهي بصورت دستي (ساعات 9 صبح و 15 بعدازظهر) تغذيه شدند.
تيمار 1: ايمن شده و تغذيه شده با غذاي حاوي عصاره لعل کوهستان.
تيمار 2: ايمن شده و تغذيه شده با غذاي حاوي عصاره مرزه خوزستان.
تيمار 3: ايمن شده و تغذيه شده با غذاي حاوي ترکيب دو عصاره.
تيمار 4: ايمن شده و تغذيه شده با غذاي معمولي فاقد عصاره.
تيمار 5: غير ايمن و تغذيه شده با غذاي حاوي لعل کوهستان.
تيمار 6: غير ايمن و تغذيه شده با غذاي حاوي مرزه خوزستان.
تيمار 7: غير ايمن و تغذيه شده با غذاي حاوي ترکيب دو عصاره.
تيمار 8: غير ايمن و تغذيه شده با غذاي معمولي فاقد عصاره.
شکل2-4 تيمار بندي ماهيان آزمايش
شکل 2-5 تزريق واکسن
2-3. نمونه گيري خون ماهيان
پس از بيهوش نمودن ماهي توسط ماده بيهوشي MS222 با دوز 30 ميلي گرم در ليتر بوسيله سرنگ انسولين آغشته به ماده ضد انعقاد هپارين از وريد ساقه دمي خونگيري انجام شد. پس از شماره گذاري لوله هاي آزمايش نمونه خون به مدت يک شب در دماي 4 درجه سانتيگراد نگهداري شده و سپس سرم آن با سانتريفوژ در 3000 دور در دقيقه به مدت 15 دقيقه جداسازي گرديد. سرم ها در 20- درجه سانتيگراد تا زمان آناليز نگهداري شدند(Stolen et al., 2000).
شکل2-6 نمونه گيري خون ماهيان آزمايش
2-4. آناليزهاي انجام شده روي نمونه ها
2-4-1. اندازه گيري ليزوزیم
براي اندازه گيري ميزان فعاليت لايزوزيم سرم از روش آگارز ليزوپليت24 توصيه شده توسط (Osserman and Lawlor, 1966) و Roed et al., 1993)) با مقداري تغييرات استفاده گرديد. در اين روش ابتدا پودر آگارز به ميزان 1% در بافر 1/0 مول فسفات سيترات/ سيترات با 8/5=pH حل گرديد. با حرارت دادن محلول به همراه هم زن مغناطيسي، بافر همراه آگارز به دماي جوش رسيده، به آرامي آگارز سرد گرديد. وقتي دماي آگارز به حدود دماي 50 درجه سانتيگراد رسيد، ميزان 2/0 ميلي گرم به ازاي هر ميلي ليتر از پودر باکتري ميکروکوکوس ليزودايکتيکوس (سيگما) به آگارز اضافه شده و قبل از تبديل وضعيت آگارز از مايع به جامد، آگارز روي پتري ديش استريل ريخته شد تا بصورت لايه اي به قطر حدود 5 ميلي متر، جامد



قیمت: تومان

دسته بندی : مقاله و پایان نامه

دیدگاهتان را بنویسید