دانشکده علوم
پایان نامه کارشناسی ارشد در رشتهی زیست شناسی (فیزیولوژی جانوری)
اثرات اوکالیپتول بر الگوی فعالیت نورونی حلزون و برهمکنش با مکانیسم های سلولی دخیل در القای فعالیت صرعی
به کوشش:
زهرا زراعت پیشه
استاد راهنما:
دکتر جعفر وطن پرست
شهریور 1392
بـه نـام خـدا
اظـهـارنـامـه
اينجانب زهرا زراعت پیشه (900790) دانشجوي کارشناسي ارشد رشته‌ي زیست شناسی گرایش فیزیولوژی جانوری اظهار مي‌کنم که اين پايان نامه حاصل پژوهش خودم بوده و در جاهايي که از منابع ديگران استفاده کرده‌ام، نشاني دقيق و مشخصات کامل آن را نوشته‌ام. همچنين اظهار ميکنم که تحقيق و موضوع پايان نامه‌ام تکراري نيست و تعهد مي‌‌نمايم که بدون مجوز دانشگاه دستاوردهاي آن را منتشر ننموده و يا در اختيار غير قرار ندهم. کليه حقوق اين اثر مطابق با آئين نامه مالکيت فکري و معنوي متعلق به دانشگاه شيراز است.
نام و نام خانوادگی: زهرا زراعت پیشه
تاریخ و امضا: 25/6/92
تقدیم به:
آنان که ناتوان شدند تا ما به توانايي برسيم…
موهايشان سپيد شد تا ماروسفيد شويم…
و عاشقانه سوختند تا گرمابخش وجود ما و روشنگر راهمان باشند…
سپاسگزاری
سپاس بی کران پروردگار یکتا را که هستی مان بخشید و به طریق علم و دانش رهنمونمان شد و به همنشینی رهروان علم و دانش مفتخرمان نمود و خوشه چینی از علم و معرفت را روزیمان ساخت.
حال که به یاری خدای منان اين فصل از زندگي علمي خود را به اتمام رساندم ، بر خود لازم ميدانم كه از استاد راهنمای فرهیخته و گرانقدرم، جناب آقای دکتر جعفر وطن پرست قدرداني و تشكر نمايم و خدا را شاکرم که افتخار این را داشتم که در محضر ایشان کسب علم نمایم. از اساتيد مشاور بزرگوار، جناب آقاي دکتر امین اله بهاء الدینی و سرکار خانم دکتر فیروزه غلامپور به خاطر راهنماییهایشان کمال تشکر و سپاس را دارم. همچنين از همه اساتيد بزرگواري كه افتخار شاگردي آنها را داشته‌ام، سپاسگزارم و قدر دانی بی پایان خود را به خانواده عزیزم که همواره یار و یاورم هستند تقدیم مینمایم.
چکیده
اثرات اوکالیپتول بر الگوی فعالیت نورونی حلزون و برهمکنش با مکانیسم های سلولی دخیل در القای فعالیت صرعی
به کوشش
زهرا زراعت پیشه
اوكاليپتول یک مونوترپن است که در اسانس روغنی بسیاری از گیاهان از جمله گیاه اوکالیپتوس وجود دارد. این ترکیب اثرات فارماکولوژیک متنوعی نشان میدهد که بسیاری از آنها برهمکنش مستقیم یا غیر مستقیم با کانالهای یونی را بکار میگیرد. در این تحقیق تاثیر اکالیپتول بر تحریکپذیری نورونهای کانگلیون زیرمری حلزون Caucasotachea atrolabiata با استفاده از تکنیک ثبت داخل سلولی مطالعه شد. اوکالیپتول (3 میلی مولار) پس از حدود 5 دقیقه، منجر به افزایش فرکانس پتانسیل‌های عمل و کاهش دامنه و مدت پتانسیل متعاقب هیپرپلاریزان گردید که میتواند بیانگر مهار جریانهای پتاسیمی رو به خارج باشد. اعمال دارو در غلظت بالاتر (mM5) سبب تغییر الگوی فعالیت نورون از حالت منظم به فعالیت انفجاری به همراه انحراف دپلاریزان گردید که این تغییرات بعد از شستشو با رینگر نرمال برگشتپذیر بود. اعمال اوکالیپتول 3 میلی مولار پس از کاربرد مهارکنندههای سنتتیک کانالهای پتاسیمی، تترااتیلآمونیوم (مهارکننده کانالهای پتاسیمی جبرانکننده تأخیری) و 4-آمینوپیریدین (مهار کننده کانالهای پتاسیمی سریع) منجر به القای فعالیت انفجاری شد که از عملکرد همسوی اوکالیپتول با این عوامل حمایت میکند. فعالیت انفجاری و انحراف دپلاریزان در حضور نیفدیپین (مهارکننده کانالهای کلسیمیL-type) و نیکل کلراید (مهارکننده غیراختصاصی کانالهای کلسیمی) حذف شد که میتواند بیانگر نقش جریانهای کلسیمی رو به داخل در تعدیل فعالیت نورونی توسط اکالیپتول باشد. H89 (مهار کننده پروتئین کیناز وابسته بهcAMP ) و کلریترین (مهارکننده پروتئین کینازC) قادر به مهار قابل توجه فعالیت انفجاری و انحراف دپلاریزان نبودند که نشان میدهند فعالیت صرعی القاء شده توسط اکالیپتول به فسفوریله شدن کانالها وابسته نیست. نتایج تحقیق حاضر نشان می‌دهد که به احتمال زیاد اوکالیپتول بواسطه‌ی مهار مستقیم کانالهای پتاسیمی تحریکپذیری نورونها را افزایش میدهد.
کلمات کلیدی: اوکالیپتول، نورون حلزون، فعالیت انفجاری، انحراف دپلاریزان، کانال‌های یونی
فهرست مطالب
عنوان ………………………………………………………………………………………………………………………………. صفحه
فصل اول: مقدمه
1-1) بیان مساله …………………………………………………………………………………………………………………………2
1-2) دلایل استفاده از نورونهای حلزون ………………………………………………………………………………… 6
فصل دوم: مروری بر تحقیقات پیشین
2-1) صرع …………………………………………………………………………………………………………………………………. 9
2-2) اسانسهای گیاهی ………………………………………………………………………………………………………… 10
2-3) اثرات بیولوژیک اسانسهای گیاهی ……………………………………………………………………………… 12
2-4) ترکیبات اسانسها و عملکرد آنها روی سیستم عصبی مرکزی و محیطی ………………… 12
2-4-1) کامفر ………………………………………………………………………………………………………………………… 13
2-4-2) منتول ……………………………………………………………………………………………………………………….. 13
2-4-3) لینالول ……………………………………………………………………………………………………………………… 14
2-4-4) اوکالیپتول ………………………………………………………………………………………………………………… 15
2-5) کانالهای یونی و مشارکت آنها در فعالیت الکتریکی نورونها ………………………………….. 17
2-5-1) کانالهای کلسیمی …………………………………………………………………………………………………… 18
2-5-2) کانالهای پتاسیمی ………………………………………………………………………………………………….. 20
2-5-2-1) کانالهای پتاسیمی وابسته به ولتاژ …………………………………………………………………….. 21
2-5-2-2) کانالهای پتاسیمی وابسته به کلسیم …………………………………………………………………. 21
2-5-3) کانالهای سدیمی ……………………………………………………………………………………………………. 23
2-5-3-1) جریانهای سدیمی گذرا و مداوم ……………………………………………………………………….. 23
2-6) پروتئین کینازها و تنظیم کانالهای یونی توسط فسفوریلاسیون ……………………………….. 24
2-6-1) PKA و اثر بر کانالهای یونی ………………………………………………………………………………….. 25
2-6-2) PKC و اثر بر کانالهای یونی ………………………………………………………………………………….. 26
فصل سوم: مواد و روشها
3-1) حیوانات …………………………………………………………………………………………………………………………. 29
3-2) تشریح و آماده سازی گانگلیون عصبی جهت ثبت ………………………………………………………. 30
3-3) محلولها و داروها …………………………………………………………………………………………………………. 31
3-4) ثبت داخل سلولی …………………………………………………………………………………………………………. 31
3-5) مراحل آزمایش ……………………………………………………………………………………………………………… 33
3-6) پارامترهای الکتروفیزیولوژیک مورد مطالعه ………………………………………………………………….. 33
3-7) آزمون آماری …………………………………………………………………………………………………………………. 35
فصل چهارم: نتایج
4-1) ویژگی‌های فعالیت خودبخودی و برانگیخته نورون‌های حلزون در شرایط کنترل ……… 37
4-2) ویژگیهای پتانسیل عمل خودبهخودی نورونهای حلزون در حضور غلظت 3 میلی مولار اوکالیپتول ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 38
4-3) ویژگیهای پتانسیل عمل خودبهخودی نورونهای حلزون در حضور غلظت 5 میلی مولار اوکالیپتول ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 44
4-4) ویژگی‌های پتانسیل عمل خودبخودی در حضور اوکالیپتول 3 میلی مولار و PTZ ……. 49
4-5) ویژگی‌های پتانسیل عمل خودبخودی در حضور اوکالیپتول 3 میلی مولار و مهار کننده‌های کانال‌های پتاسیمی 4-AP و TEA ………………………………………………………………………. 50
4-6) ویژگی‌های پتانسیل عمل خودبخودی در حضور اوکالیپتول 5 میلی مولار و مهار کننده‌های کانال‌های کلسیمی نیکل کلرید و نیفدیپین ………………………………………………………… 52
4-7) ویژگی‌های پتانسیل عمل خودبخودی در حضور اوکالیپتول 5 میلی مولار و مهار کننده‌های پروتئین کینازها کلریترین و H89 ……………………………………………………………………….. 54
فصل پنجم: بحث و نتیجهگیری
5-1) بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………… 58
5-1-1) تغییر در ویژگی‌های پتانسیل عمل در حضور اوکالیپتول ……………………………………….. 59
5-2) نتیجهگیری …………………………………………………………………………………………………………………… 63
5-3) پیشنهادات برای مطالعات آینده …………………………………………………………………………………… 64
فهرست منابع و ماخذ ……………………………………………………………………………………………………………… 65
فهرست شکلها
عنوان ………………………………………………………………………………………………………………………………. صفحه
شکل 3-1. حلزون باغی …………………………………………………………………………………………………………. 29
شکل 3-2. گانگلیون تحت مری تثبیت شده در محفظه ثبت ……………………………………………… 30
شکل 3-3. نمایی از وسایل ثبت داخل سلولی ………………………………………………………………………. 32
شکل 3-4. نحوه اندازه گیری برخی پارامترهای پتانسیل عمل ……………………………………………. 34
شکل 4-1. الگوی فعالیت خودبخودی نورون در شرایط کنترل، 5 و 10 دقیقه پس از مجاورت با اوکالیپتول 3 میلی مولار …………………………………………………………………………………………………….. 38
شکل 4-2. مقایسه پتانسیل ثبت شده از یک نورون در سه زمان کنترل، 5 و 10 دقیقه پس از افزودن اوکالیپتول 3 میلی مولار ……………………………………………………………………………………………. 42
شکل 4-3. الگوی فعالیت خودبخودی در شرایط کنترل، 5 دقیقه پس از مجاورت با غلظت mM 5 اوکالیپتول و پس از شستشوی محفظه حاوی اوکالیپتول با رینگر نرمال حلزون ……. 44
شکل 4-4. مقایسه پتانسیل ثبت شده از یک نورون در زمانهای کنترل، 5دقیقه پس از افزودن اوکالیپتول 5 میلی مولار و پس از شستشو ……………………………………………………………………………. 48
شکل 4-5. پس از افزایش فعالیت نورون درنتیجه افزودنPTZ 10 میلی مولار، افزودن اوکالیپتول 3 میلی مولار بعد از 3 دقیقه منجر به بروز الگوی burst شد …………………………….. 50
شکل 4-6. پس از افزایش فعالیت نورون درنتیجه افزودن TEA 5 میلی مولار، افزودن اوکالیپتول 3 میلی مولار بعد از 5 دقیقه منجر به بروز الگوی burst شد ……………………………. 51
شکل 4-7. پس از افزایش فعالیت نورون درنتیجه افزودن 4-AP 1 میلی مولار، افزودن اوکالیپتول 3 میلی مولار بعد از 4 دقیقه منجر به بروز الگوی burst شد ……………………………. 52
شکل 4-8. پس از بروز فعالیت PDS درنتیجه افزودن اوکالیپتول 5 میلی مولار، NiCl به محفظه ثبت اضافه گردید ………………………………………………………………………………………………………. 53
شکل 4-9. پس از بروز فعالیت PDS در نتیجه افزودن اوکالیپتول 5 میلی مولار، نیفدیپین به محفظه ثبت اضافه گردید ………………………………………………………………………………………………………. 54
شکل 4-10. پس از بروز فعالیت PDS در نتیجه افزودن اوکالیپتول 5 میلی مولار، کلریترین به محفظه ثبت اضافه گردید ………………………………………………………………………………………………………. 55
شکل 4-11. پس از بروز فعالیت PDS در نتیجه افزودن اوکالیپتول 5 میلی مولار، H89 به محفظه ثبت اضافه گردید ………………………………………………………………………………………………………. 56
فهرست نمودارها و جدولها
عنوان ………………………………………………………………………………………………………………………………. صفحه
نمودار 4-1. مقایسه میانگین پتانسیل استراحت غشاء، آستانه، فرکانس و دامنه پتانسیل عمل در شرایط کنترل و در 5 و 10 دقیقه پس از افزودن غلظت 3 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال (7=n) ………………………………………………………………………………………………………………. 39
نمودار 4-2. مقایسه میانگین مدت زمان پتانسیل عمل، فاصله بین پتانسیل‌های عمل، و سطح زیر منحنی در شرایط کنترل و در 5 و 10 دقیقه پس از افزودن غلظت 3 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال (7=n) …………………………………………………………………………….. 40
نمودار 4-3. مقایسه دامنه AHP و طول مدت AHP در شرایط کنترل و در 5 و 10 دقیقه پس از افزودن غلظت 3 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال (7=n) …………………………… 41
نمودار 4-4. مقایسه میانگین شیب فاز دپلاریزاسیون و شیب فاز رپلاریزاسیون بین سه حالت کنترل، 5 و 10 دقیقه پس از افزودن اوکالیپتول 3 میلی مولار (7=n) ………………………………… 42
نمودار 4-5. مقایسه میانگین مدت دوره مهاری بعد از فعالیت برانگیخته پس از تزریق جریان‌های دپلاریزان (nA3-2) در شرایط کنترل و 10 دقیقه پس از افزودن غلظت 3 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال ……………………………………………………………………………….. 43
نمودار 4-6. مقایسه میانگین پتانسیل استراحت غشاء، آستانه، فرکانس و فاصله بین پتانسیل‌های عمل در شرایط کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن غلظت 5 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال (6=n) ……………………………………………………………………………………………….. 45
نمودار 4-7. مقایسه دامنه و طول مدت پتانسیلهای عمل و همچنین سطح زیر منحنی در شرایط کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن غلظت 5 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال (6=n) ……………………………………………………………………………………………………………………………………… 46
نمودار 4-8. مقایسه مدت فاز دپلاریزاسیون و رپلاریزاسیون پتانسیل عمل، دامنه AHP و طول مدت AHP در شرایط کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن غلظت 5 میلی مولار اوکالیپتول به رینگر حلزونی نرمال (6=n) ……………………………………………………………………………………………………. 47
نمودار 4-9. مقایسه میانگین شیب فاز دپلاریزاسیون و شیب فاز رپلاریزاسیون بین حالت کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن اوکالیپتول 3 میلی مولار (7=n) ……………………………………….. 47
جدول4-1. مقاومت ورودی سلول در شرایط کنترل و 10 دقیقه پس از کاربرد اوکالیپتول 3 میلی مولار ………………………………………………………………………………………………………………………………. 43
جدول 4-2. مقاومت ورودی سلول در شرایط کنترل و 10 دقیقه پس از کاربرد اوکالیپتول 5 میلی مولار ………………………………………………………………………………………………………………………………. 49
فصل اول
1- مقدمه
1-1) بیان مساله
بيماري صرع1 از جمله شايعترين اختلالات عصبي در جهان است. این اختلال بصورت تشنجات خودبخوديِ غيرقابل پيشبینی بروز مي کند. صرع معمولاً در نتیجه کاهش عوامل مهاری یا افزایش شدید تحریکپذیری در بخشي از شبکه نورونی مغز رخ میدهد. در چنین شرایطی الگویی از فعالیت غیرطبیعی و شدید موسوم به الگوی فعالیت صرعی در این مجموعه نورونی شروع میشود (Fisher, 1989). تغییر در الگوی فعالیت سیناپسها و اختلال در عملکرد کانالهای یونی بعنوان دو مکانیسم اساسی زمینه ساز صرع شناخته شدهاند (Noebels, 2003; .Wuttke and Lerche, 2006) شواهد متعددی تغییر در سیستمهای نوروترنسمیتری مختلف بویژه گلوتامات، آسپارتات و GABA در ایجاد زمینه صرع را تایید کردهاند (Pinto et al., 2005) با این حال شواهدی وجود دارد که تاثیر انحصاری سیناپسها در ایجاد زمینه و بروز صرع را نقض میکنند. برخی تک سلولهای کشت داده شده بیمهرگان و مهرهداران قادر به تولید الگوی فعالیت صرعی هستند (Rosalin, 1991). همچنین مهار انتقال سیناپسی با غلظت بالای منیزیم و غلظت پایین کلسیم در مواردی قادر به مهار فعالیت صرعی نیست (Bikson et al., 1999). مدارکی از این دست اهمیت و نقش ویژگیهای ذاتی غشاء بویژه عملکرد کانالهای سدیمی، پتاسیمی و کلسیمی در بروز الگوی صرع را نشان میدهند.
با درمانهای موجود در 80% موارد میتوان حملات تشنج را کنترل کرد. عليرغم تولید تعداد قابل توجه داروهاي سنتتيک موثر در درمان انواع صرع، تاثیرات جانبی قابل توجه این داروها و نیز عدم کارایی آنها در مورد برخی از مبتلایان باعث شده تا شناسایی ترکیبات ضد صرعِ موثرتر با اثرات جانبی کمتر همچنان مورد توجه بسیاری از محققان باشد (Emamghoreishi and Heidari-Hamedani, 2008).
در طب سنتی استفاده از عصاره خام گیاهان، به صورت خوراکی یا موضعی، نقش مهمی در درمان بسیاری از بیماریها، خصوصاٌ کنترل عفونتها داشت (Navarro et al., 1996). امروزه نیز گیاهان دارویی به عنوان یک منبع مناسب برای یافتن داروهای جدید مورد توجه محققان در سراسر دنیا قرار گرفتهاست. همچنین علاوه بر استفادههای بالینی، محصولات طبیعی مذکور به منظور کشف اهداف جدیدی از جمله رسپتورها و کانالها، حائز اهمیتاند (Vriens et al., 2008).
اسانسهای گیاهی2 ترکیباتی بودار، فرار، اکثرا روان هستند که در چربی، الکل، حلالهایی با قطبیت ضعیف و به مقدار خیلی کم در آب قابل حل میباشند. این ترکیبات بی رنگ یا زرد کمرنگ و به ندرت دارای رنگ بنفشاند که در ساختارهای ترشحی برخی گیاهان ذخیره شده و قابل استخراج از بخشهای مختلف این گیاهان هستند. اسانس‌ها به طور معمول از ترپن‌های3 آروماتیک فرار و فنیل پروپانوئیدها تشکیل شده‌اند که بواسطه عبور آزادانهشان از غشاء سلول میتوانند نقشهای سیگنالینگ متنوعی در سلول داشته باشند. در این ارتباط گزارشهایی حاکی از مداخله ترکیبات اسانس‌های گیاهی با کانال‌های یونی و رسپتورها نیز وجود دارد (Goncalves et al., 2008).
تعداد معدودتری از مطالعات بر تاثیر خاص برخی ترکیبات از جمله مونوترپنها4 متمرکزند که در تعداد قابل توجهی از فراوردههای گیاهی موثر بر صرع حضور دارند. مونوترپنها ترکیباتی با فرمول مولکولی C10H16 میباشند که هم در فراوردههای گیاهی صرع زا5 و هم در فراوردههایی با اثرات ضدصرع یافت میشوند (Burkhard et al., 1999; Ishida, 2005). انواع عصارههای گیاهی و اسانسهای روغنی استخراج شده از گیاهان جهت درمان صرع استفاده میشود. تحقیقات روی این گیاهان نشان داده که عصارههای آنها حاوی ترکیباتی با خواص ضدتشنجی هستند و قادر به مهار فعالیت صرعی القاء شده توسط پنتیلن تترازول6 ((PTZ میباشند (Sayyah et al., 2002). PTZ آنتاگونیست گابا است که با مهار رسپتور گابا A باعث کاهش عملکرد سیستم گاباارژیک میشود (Olsen, 1981). از جمله مونوترپنهایی که اثرات ضدصرعی به آنها نسبت داده شد میتوان به اوجنول7، لینالول8، منتول9 و لیمونن10 اشاره کرد (Burkhard et al., 1999). از طرفی برخی از مونوترپنها ممکن است سبب االقای تشنجات صرعی در انسانها و حیوانات شود. تاثیر صرع زايي اسانس روغني برخی گياهان به مونوترپنهاي دوحلقه اي از جمله کامفر11 و اوكاليپتول12 نسبت داده شده (Burkhard et al, 1999).
اوكاليپتول یا 1,8-cineol یک مونوترپن است که در اسانس روغنی بسیاری از گیاهان از جمله اوکالیپتوس، برگبو، ریحان و شاهپسند درختچه ای یافت میشود. این ماده بی رنگ دارای بوی معطر مشابه بوی کافور است و به دلیل بو و مزه مطبوع به عنوان عطر و در ساخت لوازم آرایش مورد استفاده قرار می گیرد.
کامفر، اوكاليپتول و تركيباتي با ساختار مشابه عموماً بعنوان بيحسكنندههاي موضعي در پزشكي مصرف ميشوند (Vogt-Eisele et al., 2007) و كاربردهاي متنوع تري از جمله اثرات ضد التهابي به واسطهي اثرات مهاری آن بر تولید واسطه های التهاب مانند سیتوکین ها، پروستاگلاندینها و لوکوترینها و برخي اثرات رواني براي آنها شناخته شده است (Moussaieff et al., 2008). اوکالیپتول همچنين داراي اثرات ضد توموري و ضد ميكروبي مي باشد و انتقال دارو از طريق پوست را تسهيل ميبخشد. تاثير صرع زايي اسانس روغني برخی گياهان به این ماده نسبت داده شده است (Burkhard et al, 1999). اثرات اوكاليپتول بر پارامترهاي الكتروفيزيولوژيكي نورونهاي گانگلیون گردنی فوقانی موشهاي صحرايي نر نيز مورد بررسي قرار گرفته است. اين مطالعات نشان ميدهد كه اوكاليپتول سبب مهار تحريكپذيري اين نورونها ميشود كه ميتواند از طريق مكانيسمهاي مختلف از جمله دپلاريزاسيون غشاي سيتوپلاسمي اين نورونها عمل کند .( Ferreira-da-silva et al., 2009) اوكاليپتول فعاليت نورونها را در يك منطقه خاص از لوب بويايي تغيير ميدهد (Nikitin and Balaban, 2000) و مانع از پتانسیل عمل مرکب در نورون هاي محيطي ميشود (Lima and Lavor, et al., 2006).
اوکالیپتول نه تنها سبب تحریک سیستم بویایی میشود بلکه به واسطه مهار کانالهای کاتیونی CNG13 سبب سرکوب سیگنالهای بویایی میشود (Chen et al., 2006). اوكاليپتول همچنين آگونیست کانالهای TRPM814 (سنسور سرما) و آنتاگونیست کانالهای TRPA115 (سنسور سرمای سوزناک و درد شیمیایی) میباشد (Karashima et al., 2007) و سبب غير حساس شدن كانالهاي TRPV316 (کانالهای کاتیونی نفوذپذیر به کلسیم و حساس به گرما) نيز ميشود. اين كانالها اطلاعات مربوط به دما و درد را به سيستم عصبي مركزي انتقال ميدهد و در سلولهاي عصبي مختلف بيان ميشوند.(Patapoutian et al., 2003) عليرغم سابقه طولاني استفاده اين تركيبات در پزشكي و نيز اطلاع از صرع زايي اين تركيبات مكانيسم مولكولي تاثير کامفر و اوکاليپتول بخوبي شناخته نشده است.
با توجه به این که این ترکیبات قادر به تغییر فعالیت سلولهای عصبی اند به احتمال زیاد این ترکیبات کانالهای یونی را تحت تاثیر قرار میدهند. سلولهای عصبی قادر به بیان رنج وسیعی از کانالهای یونی اند که از میان آنها کانالهای وابسته به ولتاژ نقش مهمی در تحریک پذیری نورونها دارند. حضور انواع مختلف کانالهای یونی وابسته به ولتاژ از جمله انواع کانالهای سدیمی، پتاسیمی و کلسیمی سبب ایجاد پتانسیلهای عمل با رنج وسیعی از فرکانس و الگو میشود (Debanne, 2004) بنابراین انتقال پیام وابسته به پتانسیل عملهاییست که از فعالیت هماهنگ کانالهای یونی متنوع حاصل میشوند، هر ترکیبی که قادر به اثر گذاشتن بر ویژگی‌های پتانسیل عمل و به عبارتی کانال‌های یونی باشد در تحریک‌پذیری سلول نیز مؤثر خواهد بود (Catteral, 2010). علاوه بر ایجاد پتانسیلهای عمل کانالهای یونی در دیگر فرآیندهای فیزیولوژیکی از جمله تنظیم مسیرهای سیگنالینگ داخل سلولی، آزادسازی نوروترنسمیترها، تنظیم بیان ژن، تکثیر، تمایز، آپوپتوز و مرگ سلولی دخالت دارند. از طرفی اختلال عملکردی کانال‌های یونی می‌تواند منجر به اختلالات پاتولوژیکی شود. بمنظور تأیید تأثیر ترکیبات طبیعی بر کانال‌های یونی، استفاده از آنتاگونیست‌ها و آگونیست‌ها‌ی بسیار انتخابی لازم است (Bulaj, 2008). گزارشهایی حاکی از مداخله ترکیبات اسانس‌های گیاهی با فعالیت کانال‌های یونی و رسپتورها وجود دارد (Goncalves et al., 2008) که تکنیک‌های الکتروفیزیولوژیک برای تشخیص و شناسایی اثرات بیولوژیکی ترکیبات و چگونگی برهمکنش آن‌ها با کانال‌های یونی بسیار مؤثر هستند.
1-2) دلایل استفاده از نورونهای حلزون
در تحقیقات انجام شده روی الگوی فعالیت صرعی و روشهای درمان آن از مدلهای حیوانی مختلف استفاده شده است. با این حال مکانیسمهای اساسی ایجاد کننده الگوی فعالیت صرعی در نمونههای جانوری مختلف مشابه است. از طرفی نتایج تحقیقات مختلف نشان داده است که الگوی فعالیت صرعی ایجاد شده در نورونهای حلزون با الگوی فعالیت ثبت شده در سیستم عصبی مهرهداران از جمله انسان شباهت دارد (Janahmadi et al., 2008).
مزایای تکنیکی متعدد نورونهای گانگلیون بیمهرگان در مقایسه با نورونهای مهرهداران از جمله وجود نورونهای بزرگ قابل تشخیص، تنوع کانالهای یونی و امکان مطالعه گانگلیون در شرایط in vitro بدون تغییر در ویژگیهای ساختمانی و عملکردی باعث شده تا این نورونها در موارد متعددی جهت مطالعه مکانیسمهای پایه سیستم عصبی مورد استفاده قرار گیرند. نرم‌تنان بزرگترین نورون‌ها را در سلسله جانوران دارند و اندازه بزرگ نورون‌هایشان، شناسایی و ورود الکترود به سلول را تسهیل می‌کند و از طرفی خونسرد بودن این رده جانوری، مشکلات نگهداری آن‌ها را در شرایط in vitro کاهش می‌دهد. این عوامل باعث شدند بسیاری از مطالعات اولیه الکتروفیزیولوژیک برای نخستین بار روی نورون‌های نرم‌تنان انجام شوند (Hodgkin and Hoxley, 1939; 1952). در مقایسه با نمونههای بی مهره، مطالعه مکانیسم‌های سلولی و مولکولی در نورون‌های پستانداران اغلب مستلزم مراحل آماده‌سازی است که ممکن است همراه با تغییراتی در سازمانبندی کلی نورون‌ها باشد. بعلاوه اندازه بسیار کوچک نورون‌ها و نیاز به شرایطی با حداقل تغییرات نسبت به شرایط in vivo، انجام ثبت داخل سلولی را مشکل می‌سازد. عملکرد سیستم عصبی بی‌مهرگان و مهره‌داران از جهات بسیاری شبیه میباشد، از جمله داشتن گیرنده‌های حسی، شبکه عصبی مرکزی، خروجی‌های حرکتی و مجموعه‌ای از ناقل‌های عصبی، مسیرهای انتقال سیگنال و انواع کانال‌های یونی مشابه (Altrup et al., 1992). بنا به دلایل ذکر شده استفاده از گانگلیون حلزون در مطالعات الکتروفیزیولوژیک به نظر معقول و مفید میرسد.
فصل دوم
2- مروری بر تحقیقات پیشین
2-1) صرع
صرع از جمله اختلالات عصبی است که به صورت تشنجات خودبخوديِ غيرقابل پيشبینی و تکرار شونده بروز مي کند. تشنجات صرعی در نتیجه افزایش شدید تحریکپذیری جمعیتی از نورونها به صورت همزمان رخ میدهد که به صورت متفاوت با توجه به نواحی مغزی که در آن آغاز و سپس گسترش مییابد نمود پیدا میکند.
تشنج میتواند در ساختارهای مختلف مغزی آغاز شود. گذر به این حالت میتواند در نتیجه تغییر در غشاء نورونها شامل تغییر در کانالهای یونی، ضمائم وابسته به آنها و پروتئین های تنظیمی یا تغییر در مدارهای عصبی شامل تغییر در سیستمهای نوروترنسمیتری مختلف بویژه گلوتامات، آسپارتات و GABA باشد .(Pinto et al., 2005) شواهد متعددی تغییر در سیستمهای نوروترنسمیتری مختلف بویژه گلوتامات، آسپارتات و GABA در ایجاد زمینه صرع را تایید کردهاند (Pinto et al., 2005) همچنین با توجه به این که برخی تک سلولهای کشت داده شده بیمهرگان و مهرهداران قادر به تولید الگوی فعالیت صرعی هستند (Rosalin, 1991) و مهار انتقال سیناپسی با غلظت بالای منیزیم و غلظت پائین کلسیم در مواردی قادر به مهار فعالیت صرعی نیست (Bikson et al., 1999)، ویژگیهای ذاتی غشاء بویژه عملکرد کانالهای سدیمی، پتاسیمی و کلسیمی دارای نقش تعیینکننده در بروز الگوی صرع هستند.
مکانیسمهایی که PTZ بواسطه آنها فعالیت صرعی را القاء میکند نیز جای بحث دارد. PTZ بعنوان آنتاگونیست رسپتور گابا شناخته میشود و فعالیت صرعی حاصل از آن را به عملکرد آنتاگونیستیاش نسبت میدهند. اما مشاهداتی مغایر با این موضوع وجود دارد که از آن میان میتوان به القاء انحراف دپلاریزان (PDS)17 در هیپوکمپ بدنبال بکارگیری Bicuculin (آنتاگونیست رسپتور گابا) در مراحل تکوینی اولیه اشاره کرد (Altrup et al., 2003).
مطالعات متعدد کارایی برخی فراوردههای گیاهی در مهار یا پیشگیری فعالیت صرعی را نشان دادهاند. از طرفی اثرات نوروتوکسیک ممکن است توسط استفاده نادرست از فرآوردهها و اسانسهای گیاهی نیز ظاهر شود.
2-2) اسانسهای گیاهی
اسانسهای گیاهی از زمانهای قدیم به عنوان مواد ضد باکتری، ضد ویروس، ضد قارچ، حشرهکش و در پزشکی مورد استفاده قرار میگرفت. امروزه نیز در داروسازی، بهداشت، کشاورزی، صنایع غذایی و ساخت محصولات آرایشی کاربرد دارد .(Bakkali et al., 2008)
اسانسهای گیاهی ترکیباتی معطر، روان و فرار اند که در تعداد محدودی از گیاهان یافت میشوند. این ترکیبات در ساختارهای ترشحی ویژه گیاهان از جمله غدد، مجاری و حفرههای ترشحی و مجاری صمغی ذخیره میشوند (Ahmadi et al., 2002; Bezic et al., 2009). این ترکیبات محلول در چربی، الکل و ترکیبات با قطبیت ضعیف هستند همچنین به مقدار خیلی کم قابل حل در آب اند. اکثر آنها بیرنگ یا به رنگ زرد کمرنگ هستند و در برخی موارد از جمله اسانسهای مربوط به گیاه بابونه18 به رنگ آبی اند. به علت وجود باندهای دوگانه و گروههای عاملی از جمله گروههای آلدهیدی، استری و هیدروکسیلی در ساختار مولکولی خود به راحتی قابل اکسیداسیون توسط نور، گرما و هوا هستند .(Skold et al., 2008)
اسانسهای گیاهی متشکل از 20 الی 60 جزء با غلظتهای متفاوت میباشند (Bakkali et al., 2008) که ویژگیهای بیولوژیکی آنها ممکن است در نتیجه یک یا مجموعهای از اجزای موجود در این ترکیبات صورت گیرد. به عنوان مثال Faleiro و همکاران در سال 2003 گزارش کردند که فعالیت ضد میکروبی اسانسهای گیاهی توسط بیش از یک جزء صورت میگیرد. در واقع فقط ترکیب عمده اسانسها مسئول این اثر بیولوژیکی نیست بلکه این اثر توسط مجموعهای از اجزا صورت میگیرد.
انواع مختلفی از ملکولها از جمله هیدروکربنها، الکلها، آلدهیدها، استرها، لاکتونها و فنولها در اسانسهای گیاهی وجود دارد (Dorman and Deans, 2000). بطور کلی اسانسهای گیاهی از نظر منشأ بیوسنتزی به دو گروه مجزا تقسیم میشوند: گروه اصلی که شامل ترپنها و ترپنوئیدها میباشد، گروه دیگر که از ترکیبات آروماتیک و آلیفاتیک تشکیل شده است.
ترپن‌ها مولکولهای ساختهشده از هیدروژن و کربن هستند. این ترکیبات از لحاظ ساختاری و عملکردی از کلاس‌های مختلفی تشکیل شده‌اند و بطور کلی از ترکیب واحدهای ساختاری 5 کربنه به نام ایزوپرن19(C5H8) ایجاد میشوند. ترپن‌های اصلی شامل مونوترپن‌ها (C10) که از اتصال دو واحد ایزوپرن و سسکوئی‌ترپن‌ها20 (C15) که از اتصال سه واحد ایزوپرن تشکیل شده‌اند می‌باشند. البته ترپن‌هایی با تعداد کربنهای بیشتر نیز وجود دارد.
ترکیبات آروماتیک از فنیل پروپان مشتق شده و نسبت به ترپنها فراوانی کمتری دارند. این گروه خود شامل آلدهیدها، الکلها، فنولها، مشتقات متوکسی و ترکیبات متیلدیاکسی میباشند
2-3) اثرات بیولوژیک اسانسهای گیاهی
اثرات ضدمیکروبی، موتاژنیک، آنتیموتانژنیک و ضد سرطان از جمله اثرات نسبت داده شده به اسانسهای گیاهی میباشد. این ترکیبات به دلیل حلالیت بالا در چربی میتوانند به سهولت از دیواره سلولی و غشاء پلاسمایی عبور کرده و ساختار لایههای مختلف پلیساکاریدی، اسیدهای چرب و فسفولیپیدها را مختل کرده و در نتیجه سبب آسیب برگشتناپذیر غشای سلولی شود واز این طریق اثرات ضد میکروبی خود را اعمال میکند. اسانسهای گیاهی قادراند به غشاء و DNA میتوکندریایی آسیب زده و منجر به ایجاد جهشهایی در ژنهای مربوط به پروتئینهای دخیل در تنفس سلولی شوند(Bakkali et al., 2008; Burt, 2004) . از طرفی این ترکیبات از طریق فعال سازی آنزیمهای آنتیاکسیدان سلول (Sharma et al., 2001) و فرآیندهای سمزدایی آنزیمی21 موتاژنها اثرات آنتیموتانژنیک خود را اعمال میکنند (Kada and Shimoi, 1987). برخی از ترکیبات اسانسهای گیاهی دارای خواص ضد سرطان و ضد تومور هستند. یکی از مکانیسمهای القای این اثر توسط اسانسهای گیاهی آپوپتوز سلولهای سرطانی میباشدet al., 2002) .(Moteki
2-4) ترکیبات اسانس‌ها و عملکرد آن‌ها روی سیستم عصبی مرکزی و محیطی
از زمانهای گذشته استفاده از ترکیبات گیاهی و به ویژه ترپن‌های گیاهی به طور سنتی در سطح جهانی رواج داشتهاست. پیشنهاد شده که این ترکیبات دارای اثرات فارماکولوژیک مختلفی روی سیستم عصبی می‌باشند. این فرضیه به وسیله یکسری مطالعات انجام شده حمایت می‌شود. از جمله استفاده از اسانس رز و سنبل که باعث ایجاد اثرات ضد تشویش و ضد اضطراب در حیوان آزمایشگاهی می‌شوند (Umezu, 1999, 2000) اگرچه بیشتر مطالعات منتشر شده، نقل قول عموم در مورد استفاده از این ترکیبات برای درمان اختلالات سیستم عصبی است اما فقط تعداد کمی از مطالعات فعالیت و اثرات سمی ترکیب اصلی آن‌ها را روی سیستم عصبی توصیف کرده است. بخش کوچکی از این مطالعات در مورد برهمکنش ترپن‌ها با کانال‌های یونی و رسپتورها می‌باشد (De Sousa et al., 2006; Goncalves et al., 2010). در ادامه به بررسی اجمالی تعدادی از ترکیبات گیاهی و اثرات بیولوژیک آن‌ها می‌پردازیم.
2-4-1) کامفر
کامفر یک مونوترپن دو حلقهای کتونی است که دارای اثرات نوروتوکسیک وسقطکنندگی جنین میباشد (Gali-muhtasib et al., 2000). با این حال این ترکیب دارای اثرات درمانی نیز میباشد. کامفر سبب فعال و سپس غیر حساس شدن کانالهای TRPV3 میشود. این ماده در پزشکی به عنوان یک ضد درد مناسب، ضد التهاب و ضد خارش به کار میرود (Vog- Eisele et al., 2007; Sherkheli et al., 2008; Chan et al., 2003). Ćulić و همکاران در سال 2008 گزارش کردند که تزریق درون صفاقی کامفر در دوزهای 400-600 میکرولیتر بر کیلوگرم سبب القای تشنجات صرعی در موشهای صحرایی نر میشود.

2-4-2) منتول
منتول یک ترپن الکلی است که از گونه‌های مختلف گیاه نعناع22 بدست می‌آید (Eccles, 1994). این ترپن فعال کننده کانالهای TRPM8 میباشد (McKemy et al., 2002). در نورونهای حسی فعال شدن کانالهای TRPM8 سبب افزایش زیاد سطح کلسیم درون سلولی میشود که این افزایش به طور غیر مستقیم سبب تسهیل رهایش گلوتامات ودر نتیجه تعدیل درد محیطی میشود (Baccei et al., 2003).Zhang و همکارانش در سال 2008 نشان دادند که منتول با افزایش انتخابی مهار تونیک که بوسیله رسپتورهای با تمایل بالای گابا وساطت میشود، تحریکپذیری نورونهای هیپوکمپ را کاهش داده و از این طریق فعالیت صرعی القاء شده را تقلیل میدهد. از طرفی هوشمندی در سال 2012 گزارش کرد که منتول در غلظتهای 5/. و 1میلی مولار نه تنها اثر ضدصرعی ندارد بلکه با القاء فعالیت انفجاری23 و انحراف دپولاریزان در نورونهای حلزون دارای اثر صرعزایی مشابه الگوی صرعی ایجاد شده تحت تأثیر پنتیلن تترازول میباشد.
2-4-3) لینالول
لینالول یک ترپن الکلی میباشد که در اسانس روغنی برخی گیاهان از جمله گشنیز و برگبو وجود دارد. این گیاهان در طب سنتی به عنوان ترکیبات ضد تشنج به کار رفته و اثرات ضد صرعی آنها به علت حضور لینالول میباشد .(Elisabetsky et al., 1995; Sayyah et al. 2002). Brum و همکاران در سال 2002 گزارش کردند که لینالول اثر ضد تشنجی خود را از طریق اثر مهاری روی باند شدن گلوتامات در کورتکس موش صحرایی و تاثیر بر روی انتقالات گاباارژیک و گلوتاماتارژیک ایجاد مینماید. لینالول از طریق مهار کانالهای سدیمی وابسته به ولتاژ یا افزایش کنداکتانس پتاسیمی موجب کاهش تحریکپذیری در عصب سیاتیک میشود (de Almedia et al., 2009).
2-4-4) اوکالیپتول
اوکالیپتول که به نامهای 1,8-cineole و کاجپتول24 نیز شناخته میشود یک ترپنوئید کوچک است که در اسانسهای روغنی تعدادی از گیاهان از جمله گونههای مختلف گیاه اکالیپتوس، برگبو، ریحان و شاهپسند درختچه ای یافت میشود. این ترکیب دارای وزن مولکولی 154.24 دالتون و فرمول شیمیایی C10H16O میباشد. کمرنگ و دارای بوی معطر است و از این جهت در تولید خشبو کنندهها، ترکیبات آرایشی و چاشنیهای غذا کاربرد دارد (Vincenzi et al., 2002).
از آن جهت که این ترکیب غیرسمی میباشد همیشه به عنوان یک خلط آور مناسب، ضد سرفه و مادهای برای درمان آنفولانزا کاربرد داشته است (Laude et al 1994). اوکالیپتول همچنين داراي اثرات ضد توموري و ضد ميكروبي مي باشد (Moteki et al., 2002). این ترکیب به دلیل هیدروفوبیک بودنش انتقالات دارو از طریق پوست را افزایش میدهد (Cal et al., 2001).
مهمترین ویژگیهای این ترکیب اثرات ضدالتهاب و ضددرد آن است اوکالیپتول اثرات ضدالتهاب خود را از طریق مهار تولید واسطههای التهابی اعمال میکند. Juergens و همکاران در سالهای 1998 و 2004 گزارش کردند که اوکالیپتول سبب مهار متابولیسم آراشیدونیک اسید ومهار تولید αTNF و اینترلوکین در منوسیتهای خون انسان و مهار تولید سیتوکینها در لنفوسیتها و مونوسیتها میشود. همچنین Zhou و همکاران در سال 2007 گزارش کردند که اوکالیپتول سبب مهار سنتز و تمرکز هستهای Egr-1 (فاکتور رونویسی که نقش مهمی در بیان تعدادی از ژنهای دخیل در التهاب دارد) میشود.
اوکالیپتول اثرات ضد درد خود را به واسطه تغییر فعالیت کانالهای TRP اعمال میکند. ترکیباتی که منجر به فعال شدن کانالهای TRPM8 و مهار کانالهای TRPVA1 میشوند ترکیبات مناسب ضددرد میباشند. گرچه منتول به واسطه فعال سازی کانالهای TRPM8 به عنوان یک ضددرد در زندگی روزانه کاربرد دارد (McKemy et al., 2002; proudfoot et al., 2006) ولی توانایی آن در فعال سازی کانالهای TRPA1 در غلظت بالا استفاده از آن را به عنوان ضددرد محدود میکند(Karashima et al., 2007). اوکالیپتول توانایی زیادی در فعال سازی کانالهای TRPM8 دارد همچنین Takaishi و همکاران در سال 2012 گزارش کردند که اوکالیپتول در غلظت 5 میلی مولار سبب مهار کانالهای TRPA1 میشود بنابراین اوکالیپتول میتواند یک ترکیب ضددرد مناسب باشد. اوکالیپتول همچنین سبب فعال و سپس غیرحساس شدن کانالهای TRPV3 بعد از اعمال طولانی مدت دارو میشود (Sherkheli et al., 2009).
اوکالیپتول سبب تغییر فعالیت نورونهای بویایی میشود این ترکیب با اتصال به رسپتورهای خود در سیستم بویایی سبب فعال شدن G-پروتئین و تحریک آدنیلیل سیکلاز و به دنبال آن ایجاد cAMP میشود که cAMP سپس سبب باز شدن کانالهای کاتیونی CNG و در نتیجه سبب دپلاریزاسیون نورون میشود (Kurahashi and Ya, 1994; firestein et al., 2001). این ترکیب نه تنها محرک سیستم بویایی است بلکه سرکوبگر نیز است. Chen و همکاران در سال 2006 گزارش کردند که اوکالیپتول سبب مهار کانالهای CNG میشود. آنها همچنین بیان کردند که کانالهای هومواولیگومریک که تنها شامل زیرواحد CNGA2 هستند نسبت به کانالهای هترواولیگومریک که با زیرواحدهای فرعی CNGA4 و CNGB2 یا هر دو همراه شده دارای حساسیت کمتر به اوکالیپتول و تعدادی دیگر از مولکولهای معطر است بنابراین احتمالا ناحیه اتصالی این ذرات بر روی زیرواحدهای فرعی مستقر است همچنین این احتمال وجود دارد که این ذرات به وسیله اختلال در غشای لیپیدی که به واسطه هیدروفوبیک بودن خود ایجاد میکند سبب تغییرات عملکردی در پروتئینها و کانالهای یونی غشاء شوند.
Ferreira-da-silva در سال 2009 اثرات اوکالیپتول بر فعالیت نورونهای کانگلیون گردنی فوقانی25 موشهای صحرایی مورد مطالعه قرار دادند. آنها گزارش کردند که اوکالیپتول درغلظتهای 3 و 6 میلی مولار از طریق القای دپلاریزاسیون و در نتیجه غیر فعال سازی کانالهای سدیمی سبب کاهش تحریکپذیری در این نورونها میشود زیرا تزریق جریانهای منفی داخل سلولی سبب بازگشت امواج پتانسیل عمل میشد. القای دپلاریزاسیون ممکن است از طریق هدایت جریانهای کاتیونی رو به داخل صورت گیرد. اوکالیپتول همچنین مانع از پتانسیل عمل مرکب در نورون هاي محيطي ميشود (Lima and Lavor et al., 2006).
به اوکالیپتول خواص صرعزا نیز نسبت داده شده است (Bakkali et al., 2008). Ćulić و همکاران در سال 2009 بیان کردند که تزریق درون صفاقی اوکالیپتول در دوزهای 300-500 میکرولیتر بر کیلوگرم سبب القای تشنجات صرعی در موشهای صحرایی نر میشود. استفاده نادرست از این ترکیب میتواند اثرات نوروتوکسیک به همراه داشته باشد.
با توجه به برهمکنش احتمالی اوکالیپتول با کانالهای یونی در ادامه مروری خواهیم داشت بر انواع کانالهای یونی و مشارکت آنها در ویژگیهای الکتریکی نورونها.
2-5) کانالهای یونی و مشارکت آنها در فعالیت الکتریکی نورونها
نورونها سلولهای تحریکپذیریاند که وظیفه دریافت، پردازش و انتقال اطلاعات را بر عهده دارند. این فرآیندها از طریق سیگنالهای الکتریکی تولید شده توسط فعالیت کانالهای یونی وابسته به ولتاژ و پتانسیلهای سیناپسی ناشی از فعالیت گیرندههای نوروترنسمیتری صورت میگیرد. وجود انواع کانالهای یونی با ویژگیها و موقعیت متفاوت موجب ایجاد پتانسیلهای عمل با رنج وسیعی از فرکانس و الگو میشود (Debanne, 2004) بنابراین هرگونه تغییر در عملکرد آنها موجب تغییر در فعالیت طبیعی نورون میشود. احتمالا اغلب مسیرهای درگیر در تاثیر مواد مختلف بر نورون‌ها نهایتا به کانال‌های یونی و تغییر در عملکرد آن‌ها ختم می‌شود.
2-5-1) کانالهای کلسیمی
کانالهای کلسیمی واسطه مهم ورود کلسیم به داخل سلول هستند که در سلولهای مختلف از جمله نورونها، سلولهای اندوکرین و عضلانی وجود دارند. ورود کلسیم به داخل سلول سبب راهاندازی فرایندهای مختلف میشود. از آنجا که کلسیم یونی با دو بار مثبت است با ورود به سلول سبب نوسانات پتانسیل غشاء و ایجاد پتانسیلهای عمل میشود همچنین میتواند عملکرد سایر کانالها را نیز تحت تاثیر قرار دهد. یون کلسیم از جمله مهمترین پیامبرهای ثانویه میباشد و سبب راهاندازی انواعی از مسیرهای سیگنالینگ داخل سلولی میشود. آزاد سازی نوروترانسمیترها، تنظیم بیان ژن، تکثیر، تمایز، آپوپتوز ومرگ سلولی دیگر فرآیندهای القا شده توسط کلسیم هستند(Perez-Reyes, 2003; Calpham, 2007; Seagar and Takahashi, 1998).
کانالهای کلسیمی وابسته به ولتاژ26 پروتئینهای عرضی غشاء هستند که ورود کلسیم به داخل سلول را طی دپلاریزاسیونهای غشایی امکانپذیر میسازند. این کانالها به مقدار اندک به یونهای سدیم نفوذپذیرند اما نفوذپذیری به کلسیم هزار برابر سدیم میباشد. در یک تقسیم بندی اولیه این کانالها با توجه به پتانسیل غشایی که در آن فعال میشوند به دو دسته HVA27 و LVA28 تقسیم میشوند. کانالهای HVA نسبت به کانالهای LVA برای فعالیت خود به دپلاریزاسیون غشایی بیشتر احتیاج دارند همچنین طی دپلاریزاسیونهای طولانی مدت جریان کلسیمی طولانیتری ایجاد میکنند.
مهمترین زیرواحد این کانالها زیرواحد 1α میباشد. این زیرواحد از حدود 2000 اسید آمینه تشکیل شده و وزنی حدود 200-260 کیلودالتون دارد و از آن جهت که منفذ هدایتگر یون، سنسور ولتاژ و ساختارهای لازم برای gating و برهمکنش با پروتئینهای تنظیمی، دارو و سموم را فراهم میآورد حائز اهمیت است. در کانالهای HVA زیرواحد 1α با تعدادی زیرواحد فرعی β، α2، γ و δ گرد هم آمده و یک کمپلکس کانالی راتشکیل میدهد. (Ertel et al., 2000; Catterall et al., 2005). این زیرواحدهای فرعی اثرات مهمی بر کنتیک، وابستگی به ولتاژ و ویژگیهای فارماکولوژیکی این کانالها دارند. به نظر میرسد کانالهای LVA فاقد این زیرواحدهای فرعی باشند.
رایجترین تقسیمبندی کانالهای کلسیمی بر اساس معیارهایی چون کنداکتنس، کنتیک فعال و غیر فعال شدن و ویژگیهای فارماکولوژیک آنها میباشد. طی این تقسیمبندی کانالهای HVA به انواع کانالهای L-type، N-type، P/Q-type و R-type، تقسیمبندی میشوند. (Tsien et al., 1987).
کانالهای L-type برای فعال شدن خود به دپلاریزاسیون بالا احتیاج دارند و دارای هدایت یونی بالا هستند. این کانالها بیشتر در جسم سلولی و دندریتهای نزدیک نورونها قرار دارند و مسیرهای سیگنالینگ داخل سلولی را به راه میاندازند. مهمترین مهار کننده این کانالها دیهیدروپیریدینها میباشند (Catterall et al., 2005).
کانالهای N-type، P/Q-type و R-type برای فعال شدن خود به دپلاریزاسیون غشایی کمتر از کانالهای L-type احتیاج دارند. توکسین‌های پلی‌پپتیدی ویژه‌ای از سموم عنکبوت، حلزون و رطیل مانند IVA –agatoxinω، Conotoxin GVIA و SNX-482 به ترتیب کانال‌های P/Q، N و R را مهار می‌کنند (Adams et al., 1993). این کانالها به مقدار زیاد در پایانههای سیناپسی نورونهای مرکزی و محیطی بیان میشوند و فعالیت آنها منجر به آزادسازی نوروترانسمیترها میشود. کانالهای N-type بیشتر مرتبط با انتقالات مهاری هستند و کانال های P/Q-type بیشتر مرتبط با آزادسازی نوروترانسمیترهای تحریکی هستند اما انتقالات مهاری را نیز حمایت میکند (Burke et al., 1993; Caddick et al., 1999). موش‌هایی با جهش در کانال‌های P/Q درجاتی از تشنجات غائب29 را نشان می‌دهند(jouvenceau et al., 2001) .
کانالهای LVA به علت جریانهای گذرایی که ایجاد میکنند T-type نیز نامیده میشوند. این کانالها در پتانسیل غشایی نزدیک پتانسیل استراحت غشاء (حدود 70- میلیولت) فعال میشوند، هدایت یونی پایین و دوره باز بودن کوتاه دارند. از مهارکننده‌های رایج این نوع جریانات کلسیمی می‌توان میبفرادیل30، کورتوکسین31 (سم عقرب) و یون‌های نیکل را نام برد (Perez-Reyes, 2003; Catterall et al., 2005). این کانالها بیشتر در جسم سلولی و دندریت نورونها بیان میشوند. ویژگی قابل توجه این کانالها توانایی آنها در ایجاد اسپایکهای کلسیمی با آستانه کم و در نتیجه ایجاد فعالیتهای انفجاری، ایجاد جریان پنجرهای و در نتیجه ایجاد نوسانات آهسته غشایی میباشد. مطالعات متعددی وجود کانال‌های کلسیمی نوع L و T را در نورون‌های حلزون نشان داده‌اند. مشخص شده که 55% از جریان‌های کلسیمی در نورون‌های حلزون از نوع L و مابقی از نوع T می‌باشد(Faizi et al., 2003; Vatanparast et al., 2006; Senatore and Spafford, 2010).
2-5-2) کانالهای پتاسیمی
کانالهای پتاسیمی به واسطه خروج یونهای پتاسیم از سلول بر اساس گرادیان الکتروشیمیایی منجر به تقلیل تحریکپذیری غشاء میشود (Yuan and Chen, 2006). این کانالها نقش مهمی در تثبیت و حفظ پتانسیل استراحت غشاء، تنظیم مدت زمان پتانسیل عمل، تنظیم تحریکپذیری یک نورون منفرد و کنترل قدرت سیناپسی بین نورونها ایفا میکند (Vatanparast et al., 2006). کانالهای پتاسیمی وابسته به ولتاژ و کانالهای پتاسیمی وابسته به کلسیم از مهمترین این کانالها میباشند که در ادامه به آنها اشاره خواهد شد.
2-5-2-1) کانالهای پتاسیمی وابسته به ولتاژ
کانال‌های پتاسیمی وابسته به ولتاژ، تنظیم کننده طول مدت فاز رپلاریزاسیون پتانسیل عمل، هیپرپلاریزاسیون متعاقب (AHP) و فاصله بین اسپایک‌ها می‌باشند (Edgerton et al., 2003). از جمله مهمترین آنها عبارتاست از، کانالهای پتاسیمی جبرانکننده تأخیری32 (KDr) که به خاطر کنتیک فعال شدن آهسته احتمالاً در فاز رپلاریزاسیون و تعیین مدت پتانسیل عمل مشارکت میکنند، کانالهای پتاسیمی سریع (A-type) که بواسطه کنتیک بسیار سریعشان در ایجاد فعالیت با فرکانس بالا مشارکت دارند (Jonas et al., 2004) همچنین جریانهای پتاسیمی نوع M که کنتیک آهستهتر از کانالهای KDr دارند و معمولاً بعنوان کانالهایی که غیرفعال نمیشوند شناخته میشوند و بواسطه همین ویژگیشان در پدیده تطابق33 مشارکت دارند (Storm, 1990).
2-5-2-2) کانالهای پتاسیمی وابسته به کلسیم
در بسیاری از نورونها ورود کلسیم طی پتانسیلهای عمل سبب فعالسازی برخی از انواع کانالهای پتاسیمی میشود. این کانالها در سلولهای تحریکپذیر اهمیت بسزایی دارند و در ایجاد رپلاریزاسیون و هیپرپلاریزاسیون متعاقب پتانسیل عمل (AHP) مشارکت دارند (Vatanparast et al., 2007). این کانالها بر اساس ویژگیهای بیوفیزیکی و فارماکولوژیکی به 3 دستهی BK، SK و IK تقسیم میشوند (Vegara et al., 1998).
کانالهای BK نخستین بار در غشای سلول‌های کرومافین (Marty A, 1981) و عضله اسکلتی موش (Pallotta et al., 1981) و پس از آن در بسیاری دیگر از سلول‌ها شناسایی شدند. این کانالها هدایتپذیری بالایی داشته و فعال شدنشان مستلزم دپلاریزاسیون غشاء و حضور کلسیم میباشد (McManus, 1991) همچنین بوسیله غلظتهای کم تترااتیلآمونیوم34، iberiotoxin و paxilline مهار میشوند (Faber and Sah, 2003; Galvez et al., 1990). از نظر عملکردی کانالهای BK در رپلاریزاسیون سریع و نیز در AHP سریع35 نقش دارند. بنابراین مهار این کانالها منجر به کاهش تحریکپذیری و کاهش فرکانس پتانسیل عمل در سلول میشود (Gu et al., 2007). هر عاملی که باعث افزایش غیرطبیعی هدایت کانالهای BK شود، مثل جهش در زیرواحدهای اصلی (α)، منجر به افزایش غیرنرمال تحریکپذیری و بروز اختلالاتی از جمله صرع میشود (Du et al., 2005).
کانالهای IK دارای هدایتپذیری متوسطی میباشند، به ولتاژ غیرحساساند، در نورونها یافت نمیشوند و در سلولهای محدودی مثل گلبولهای قرمز و سلولهای اپتلیالی بیان میشوند (Ishii et al., 1997).
کانالهای SK در بخش‌های مختلف سیستم عصبی مرکزی به ویژه در سیستم لیمبیک و با تعداد کمتر در نواحی مانند نئوکورتکس و مخچه بیان می‌شوند، البته در بخش‌های محیطی نیز یافت می‌شوند (Kohler et al., 1996). این کانالها دارای هدایتپذیری کمتر نسبت به دو مورد دیگر بوده و فعال شدنشان تنها وابسته به حضور کلسیم میباشد و بوسیله apamin مهار میشوند (McManus, 1991; Hallaworth et al., 2003). برخلاف کانال‌های BK کانال‌های SK در رپلاریزاسیون پتانسیل عمل شرکت نمی‌کند. این کانالها بیشتر مسئول فاز AHP آهسته36 و متوسط37 میباشند (Sah and McLachlan, 1992) بنابراین نقش اساسی در کنترل فرکانس پتانسیلهای عمل و الگوی فعالیت بسیاری از نورونها ایفا میکند. همچنین پیشنهاد شده که کانال مذکور در پدیده تطابق (accommodation) نوعی مکانیسم مهاری در برابر افزایش بیش از حد فرکانس نیز دخالت دارد (Yen et al., 1999).
2-5-3) کانالهای سدیمی
کانالهای سدیمی وابسته به ولتاژ نقش مهمی در تنظیم تحریکپذیری الکتریکی سلولها ایفا میکنند و اساساً مسئول فاز دپلاریزاسیون پتانسیلهای عمل در نورونها میباشند همچنین برای شروع و انتشار پتانسیل‌های عمل در نورون‌ها ضروری هستند. این کانالها از یک زیرواحد α و دو‌زیر‌واحد مجزای β شامل 1β و 2β تشکیل شدهاست. زیر واحد آلفا دارای نقش عملکردی اساسی در کانال های سدیمی است و جایگاهی برای اعمال اثر ترکیبات مختلف مثل تترودوتوکسین38 (بلوکر کانال سدیمی)، ساکسی‌توکسین39 (بلوکر کانال سدیمی) و سم عقرب40 (فعال کننده کانال سدیمی) می باشد. از این رو پیشنهاد شد که زیرواحد مذکور هم در هدایت یونی و هم در فرایند gating کانال دخیل می‌باشد. مطالعات نشان داده‌اند که کمپلکس 1βα برای عملکرد کانال لازم و کافی می‌باشند و حدس زده می‌شود که زیرواحد‌های 1β جهت ایجاد ثبات در حالت عملکردی کانال مورد نیاز هستند (Catterall, 1995).
2-5-3-1) جریان‌های سدیمی گذرا و مداوم
جریان سدیمی وابسته به ولتاژ شامل ورود گذرای سدیم است که منجر به دپلاریزاسیون غشاء می‌شود. کانال سدیمی بسته به پتانسیل غشاء میتوانند سه حالت عملکردی متفاوت داشته باشند: بسته، باز (فعال) و غیر فعال. جریان‌های عبوری از میان کانال‌های باز کنتیک سریعی دارد و در کمتر از یک میلی ثانیه به اوج می‌رسد و در حد چند میلی ثانیه در حد پایه کاهش می‌یابد (Cummins et al., 1994).
در حالیکه INa جریان مسئول فعالیت نورونی است، اما شواهدی مبنی بر حضور یک جریان سدیمی مداوم (INap)41 که مخصوصاً در تعدیل تحریک‌پذیری نورونی مؤثر می‌باشد، نیز وجود دارد. این جریان در انواعی از نورون‌ها از جمله آکسون اسکوئید، تالاموس، استریاتوم و نئوکورتکس انسان گزارش شده است و معمولاٌ تنها کسر کوچکی (%3-1) از کل جریان پیک سدیم را در نورونها نشان می‌دهد، با این حال می‌تواند الگوی تولید پتانسیل عمل را بشدت تحت تأثیر قرار دهد (Crill, 1996; Wu et al., 2005).
هنوز جای بحث است که آیا جریان سدیمی مداوم از یک کانال وابسته به ولتاژ متفاوت از کانال سدیمی وابسته به ولتاژ گذرا منشأ می‌گیرد یا نه. یک تئوری اینست که INap بوسیله یک زیرگروه اختصاصی از کانال‌های سدیمی تولید می‌شود. شواهدی که این فرضیه را حمایت می‌کنند نشان می‌دهند که INap آستانهای حدود 10 میلی ولت کمتر از INa دارد. اما از سوی دیگر مشخص شده که INap معمولا بوسیله همان مهارکنندههای INa مانند تترودوتوکسین مهار می‌شود. مطالعات بیولوژی مولکولی نشان می‌دهند که به احتمال قوی هر دو جریان مذکور از یک کانال منشأ می‌گیرند، با این تفاوت که شیوه gating کانال در این جریان‌ها یکسان نیست (یک روش Slow-gating برای جریان INap وجود دارد) (Stafstrom, 2007).
2-6) پروتئین کینازها و تنظیم کانالهای یونی توسط فسفوریلاسیون
طی تحقیقات در نورونهای پستانداران و سلولهای غیر عصبی، مشخص شد که مسیرهای سیگنالینگ داخل سلولی متعدد منجر به فسفوریلاسیون کانالهای یونی در نواحی خاص داخل سلولی میشود(Iskander et al., 1995) . فسفوریلاسیون منجر به تعدیل رفتارهای فیزیولوژیکی کانال از جمله تغییر کنتیک فعال و غیر فعال شدن کانال، احتمال باز شدن و میانگین زمانی باز بودن کانال میشود. تغییر عملکرد کانالهای یونی توسط فسفوریلاسیون در نورونها میتواند تحریکپذیری را تحت تاثیر قرار دهد. مسیرهای سیگنالینگ مربوط به پروتئین کینازها42 از جمله مهمترین مسیرهای درگیر در فسفوریلاسیون کانالهای یونی اند.
پروتئین کینازها به واسطه فسفوریله کردن پروتئینها منجر به تغییر در فعالیت آنها میشوند. این آنزیمها نقش اساسی در یکپارچگی شبکههای سیگنالینگ در سلولهای یوکاریوت دارند و فرایندهای سلولی بیشماری از جمله رشد، تمایز، تکوین، عملکرد و مرگ سلول را تنظیم میکنند (Cheetham, 2004, Kondapalli et al., 2005). فعالیت رسپتورهای متابوتروپیک43 از جمله مسیرهای فعال کننده پروتئین کینازها میباشند. پروتئین کینازها بر اساس آمینواسیدهایی که مورد هدف قرار میدهند به دو دسته تقسیم میشوند دسته اول تیروزین کینازها هستند که اسیدآمینه تیروزین را فسفریله کرده و خود شامل دو گروه تیروزین کیناز رسپتوری و تیروزین کیناز غیر رسپتوری میباشند (Shchemelinin, 2006). دسته دوم سرین-ترئونین کینازها هستند که سرین و ترئونین را فسفریله میکنند و محلول در سیتوپلاسم هستند. پروتئین کیناز A و C جزء دسته اخیر میباشند.
2-6-1) PKA و اثر بر کانالهای یونی
PKA توسط سیگنالهای خارج سلولی که منجر به افزایش cAMP میگردد فعال میشود به عنوان مثال رسپتورهای متابوتروپیک گلوتامات نوع یک منجر به فعالسازی آدنیلیل سیکلاز و افزایش سطح cAMP میشود(Hermans and Challiss, 2001) . PKA از دو زیرواحد کاتالیکی و دو زیرواحد تنظیمی تشکیل شدهاست که در حالت غیرفعال دو زیرواحد تنظیمی به یکدیگر متصلاند و همچنین جایگاههای فعال زیرواحد کاتالیکی را میپوشانند. پروتئینهای لنگری کیناز A که بعنوان داربست برای PKA به کار میروند، آنزیم را بوسیله پایانه آمینی زیرواحد تنظیمی در جایگاههای خاص در سلول متمرکز میکنند. زیرواحد تنظیمی دارای دو دمین متصل شونده به cAMP در پایانه کربوکسیلی خود میباشند. با اتصال چهار cAMP به ناحیه اتصالی، زیرواحد تنظیمی از زیرواحد کاتالیکی جدا میشود. زیرواحد کاتالیکی آزاد به واسطه دمین انتهایی آمینی خود که به ATP متصل میشود و دمین انتهایی کربوکسیلی که ناحیه متصل شونده به سوبسترای پروتئینی میباشد سوبسترای خود را در نواحی خاص فسفوریله میکند. کانالهای یونی شامل نواحی داخل سلولی برای فسفوریلاسیون هستند 4 ناحیه فسفوریلاسیون برای کانالهای سدیمی شناسایی شده که فسفوریله شدن این نواحی منجر به تعدیل عملکرد کانالهای سدیمی میشود. تیمار شدن نورونها توسط فعال کننده PKA (forskolin)، منجر به کاهش احتمال باز شدن کانالهای سدیمی و در نتیجه کاهش جریان سدیمی میشود (Li et al., 1992). Smith و Goldin در سال 1992 گزارش کردند که در کانالهای سدیمی مغز موش تنها فسفوریلاسیون یک ناحیه برای کاهش جریانهای سدیمی ضروری و کافی است که این کاهش جریان میتواند در نتیجه کاهش مدت زمان باز بودن کانال یا کاهش تعداد کانالهایی که قادر به باز شدن هستند باشد با این حال گزارشاتی مبنی بر افزایش جریان سدیمی توسط PKA نیز وجود دارد (Iskander et al., 1995). فسفوریلاسیون کانالهای کلسیمی وابسته به ولتاژ به وسیله PKA سبب افزایش احتمال باز شدن کانال از طریق کاهش آستانه باز شدن کانال و در نتیجه افزایش جریان کلسیمی میشود (Sculptoreanu et al., 1993). به دلیل تنوع زیاد کانالهای پتاسیمی PKA هم دارای اثر مهاری و هم تحریکی بر این کانالها میباشد. Bastin و همکارانش در سال 1999 گزارش کردند که PKA از طریق فسفوریلاسیون کانالهای پتاسیمی وابسته به کلسیم منجر به کاهش میزان جریانهای پتاسیمی در لنفوسیتهای T میشود.

2-6-2) PKC و اثر بر کانالهای یونی
PKC برای فعالیت خود به دیاسیلگلیسرول و در برخی موارد کلسیم نیاز دارد. دیاسیلگلیسرول در نتیجه هیدرولیز برخی لیپیدها ایجاد میشود. فعالیت رسپتورهای متابوتروپیک گلوتامات نوع یک قادر به فعالسازی فسفولیپازC و در نتیجه تولید اینوزیتولتریفسفات و دی اسیلگلیسرول به واسطه هیدرولیز فسفاتیدیلاینوزیتول میباشد(Hermans and Challiss, 2001). این آنزیم دارای چهار دمین (C1-C4) میباشد. C1 حاوی موتیفهای لازم برای اتصال به دیاسیلگلیسرول، C2 دارای نواحی شناختهشده برای اتصال لیپیدهای اسیدی و در بعضی موارد کلسیم و C3 و C4 نواحی متصلشونده به ATP و سوبسترا را تشکیل میدهند. برخی از این کینازها به دلیل فقدان C2 غیر وابسته به کلسیم میباشند (Koya and L. King, 1998). شواهد نشان میدهد که تغییر عملکرد کانالهای سدیمی توسط PKC وابسته به غلظت است. در غلظتهای پایین دیاسیلگلیسرول یا PKC کانالهای سدیمی آهستهتر غیر فعال میشود در حالی که در غلظتهای بالا میزان جریانهای سدیمی کاهش مییابد (Numann et al., .1999) تعدیل کانالهای کلسیمی توسط PKC منجر به افزایش میزان



قیمت: تومان

دسته بندی : مقاله و پایان نامه

دیدگاهتان را بنویسید