دانشکده علوم
پایان نامهی کارشناسی ارشد در رشتهی
زیست شناسی سلولی – مولکولی
بررسی ارتباط چند شکلیهای ژنتیکی GPX1 pro198leu و SOD1 A251G با خطر رد حاد پیوند کلیه
به کوشش:
شیما رعیت‌پیشه
استاد راهنما:
دکتر ایرج سعادت

شهریور1393
به نام خدا
اظهار نامه
اینجانب شیما رعیتپیشه (9133360) دانشجوی رشته‌ی زیستشناسی گرایش سلولی و مولکولی دانشکده‌ی علوم اظهار می‌کنم که این پایان‌نامه حاصل پژوهش خودم بوده و در جاهایی که از منابع دیگران استفاده کرده‌ام، نشانی دقیق و مشخصات کامل آن را نوشته‌ام. همچنین اظهار می‌کنم که تحقیق و موضوع پایان‌نامه‌ام تکراری نیست و تعهد می‌نمایم که بدون مجوز دانشگاه دستاوردهای آن را منتشر ننموده و یا در اختیار غیر قرار ندهم. کلیه‌ی حقوق این اثر مطابق با آیین نامه مالکیت فکری و معنوی متعلق به دانشگاه شیراز است.
نام و نام خانوادگی: شیما رعیت پیشه
امضا و تاریخ
تقدیم به:
مادر و پدر مهربانم
و
خواهران عزیزم
سپاسگزاری
ستایش خدای را سزاست که به ید قدرت بی منتهایش دریای آفرینش را جاری کرد و به اراده ازلیاش همه خلق را صورت بخشید. سپاسگزار کسانی هستم که سرآغاز تولد من هستند. مادرم، مهربانی که زیستن را از او آموختم و پدرم، استوارترین تکیهگاهم.
مراتب قدردانی خود را نسبت به زحمات بیدریغ استاد راهنمای ارجمندم جناب آقای دکتر ایرج سعادت و اساتید مشاور آقایان دکتر مصطفی سعادت و دکتر محمدحسین کریمی به پاس کمکها و رهنمودهای سازندهشان در انجام این پژوهش ابراز میدارم.
امید دارم که تهیه و تدوین پایاننامه حاضر پاسخگوی بخشی کوچک از محبتها و زحمات آنان باشد.
چکیده
بررسی ارتباط چند شکلیهای ژنتیکی GPX1 pro198leu و SOD1 A251G
با خطر رد حاد پیوند کلیه
به کوشش:
شیما رعیتپیشه
پیوند کلیه راهکار درمانی برای بیماران مبتلا به مرحله نهایی بیماری کلیوی است. با وجود افزایش و پیشرفت چشمگیر این روند درمانی، هنوز به دلیل پاسخ ایمنی فرد گیرنده در برابر بافت دهنده، رد پیوند شایع و عامل اصلی عدم موفقیت این روش است. کلیه پیوندی مستعد قرار گرفتن در معرض رد حاد به دلایل متفاوت از جمله استرسهای اکسیداتیو است. استرس اکسیداتیو با تاثیر منفی بر عمر و عملکرد بافت پیوندی میتواند نهایتا منجر به رد پیوند گردد. آنزیمهای GPX1 و SOD1 از جمله آنزیمهای آنتیاکسیدان هستند. هدف از این پژوهش بررسی ارتباط چندشکلیهای GPX1 pro198leu (rs1050450) وA251G SOD1(rs2070424) با رد حاد پیوند کلیه است. در این مطالعه 262 بیمار دریافت کننده پیوند کلیه که 46 نفر از آنها دارای رد حاد بودند و 262 فرد سالم به عنوان کنترل مورد بررسی قرار گرفتند. تعیین ژنوتیپها با روش PCR-RFLP انجام و دادهها توسط نرمافراز آماری SPSS تحلیل شدند. پس از بررسی فراوانی آللی و ژنوتیپی در چندشکلی pro198leu GPX1 بین دو گروه بیمار و کنترل و همچنین بیماران دارای رد حاد و فاقد رد حاد پیوند کلیه تفاوت معناداری مشاهده نشد. به عبارت دیگر فراوانی آللی و ژنوتیپی ژن GPX1 در چندشکلی یاد شده در بروز بیماریهای کلیوی منجر به پیوند و همچنین رد حاد پیوند کلیه نقشی ندارد. در بررسی چندشکلی A251G از ژن SOD1 نیز اختلاف معناداری میان دو گروه شاهد و بیمار و دارای رد پیوند و فاقد رد حاد پیوند مشاهده نشد. نتایج نشان میدهند که چندشکلی SOD1 A251G در ابتلا به بیماریهای منجر به پیوند کلیه و همینطور رد حاد پیوند دخیل نیست.
واژگان کلیدی: پیوند کلیه، رد حاد، استرس اکسیداتیو، GPX1، SOD1
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه
1-1- پیوندکلیه ……………………………………………………………………………………………………………….21-2- رد پیوند …………………………………………………………………………………………………………………3 1-2-1- رد فوق حاد ………………………………………………………………………………………………………3 1-2-2- رد حاد ……………………………………………………………………………………………………………..4 1-2-3- رد مزمن ……………………………………………………………………………………………………………41-3- پیشگیری از رد آلوگرافت ………………………………………………………………………………………51-4- استرس اکسیداتیو ………………………………………………………………………………………………….71-5- گلوتاتیون پراکسیداز 1 (GPX1) …………………………………………………………………………..81-6- سوپراکسیددسموتاز1 (SOD1) …………………………………………………………………………….91-7- هدف ………………………………………………………………………………………………………………………111-8- فرضیه …………………………………………………………………………………………………………………….11
فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده
2-1- مطالعات انجام شده بر روی چند شکلی GPX1 pro198leu و ارتباط آن با بیماریهای گوناگون ……………………………………………………………………………………………………………
132-2- مطالعات انجام شده بر روی چند شکلی SOD1 A251G و ارتباط آن با بیماری های گوناگون………………………………………………………………………………………………………………………..
142-3- مطالعات انجام شده بر روی رد حاد پیوند کلیه ……………………………………………………….. 15
فصل سوم: مواد و روش انجام کار
3-1- نمونهگیری ………………………………………………………………………………………………………………… 183-2- وسایل مورد استفاده ………………………………………………………………………………………………….193-3- مواد مورد استفاده ……………………………………………………………………………………………………..19 3-3-1- محلولهای لازم جهت استخراج ………………………………………………………………………19 3-3-2- مواد استفاده شده جهت انجام PCR ……………………………………………………………….20 3-3-3- مواد استفاده شده جهت انجام الکتروفورز ………………………………………………………..20 3-3-4- مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزیم محدود کننده ………………………………….. 203-4- استخراج DNA به روش جوشاندن (Boiling) ………………………………….. ……………….21 3-4-1- ساخت محلولهای مورد نیاز جهت استخراج …………………………………………………..21 3-4-2- فرآیند استخراج به روش جوشاندن ………………………………………………………………….213-5- تعیین ژنوتیپ با روش PCR-RFLP ………………………………………………………………………21 3-5-1- PCR …………………………………………………………………………………………………………………21 3-5-2- پرایمرهای مورد استفاده …………………………………………………………………………………..223-6- تعیین ژنوتیپ برای چند شکلی GPX1pro198leu ………………………………………………..233-7- تعیین ژنوتیپ برای چند شکلی SOD1A251G ……………………………………………………..243-8- الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………………………….253-9- رنگآمیزی ژل …………………………………………………………………………………………………………..263-10- تحلیل آماری …………………………………………………………………………………………………………..27
فصل چهارم: نتایج
4-1- مشخصات افراد شرکت کننده در این پژوهش …………………………………………………………294-2- بررسی عوامل خطر دخیل در رد حاد پیوند کلیه …………………………………………………… 294-3- بررسی چند شکلی ژن GPX1 pro198leu درافراد سالم و بیماران ……………………….314-4- بررسی چند شکلی ژن GPX1 pro198leu در بیماران دارای رد حاد و فاقد رد حاد پیوند کلیه ……………………………………………………………………………………………………………………
334-5- بررسی چند شکلی ژن SOD1 A251G درافراد سالم و بیماران …………………………….. 36
4-6- بررسی چند شکلی ژن SOD1 A252G در بیماران دارای رد حاد و فاقد رد حاد پیوند کلیه ……………………………………………………………………………………………………………………………
384-7- بررسی همزمان اثر چند شکلیهای GPX1 pro198leu و SOD1 A251G ………….
40فصل پنجم: بحث و نتیجهگیری
5-1- بحث و نتیجهگیری ……………………………………………………………………………………………………. 435-2- پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………….47
فهرست منابع …………………………………………………………………………………………………………………….48
فهرست جدولها
عنوان صفحه
جدول3-1: مشخصات افراد مورد مطالعه ……………………………………………………………………………..18جدول 3-2: مواد مورد نیاز برای انجام PCR ……………………………………………………………………….22جدول3-3: برنامه تنظیم شده PCR برای تکثیر ژن GPX1 در 26 سیکل ……………………….23جدول3-4: قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های چندشکلی ژنتیکی GPX1pro198leu ………………………………………………………………………………………………………………..
24جدول3-5: برنامه تنظیم شده PCR برای تکثیر ژن SOD1 در 30 سیکل ……………………….24جدول3-6: قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های چندشکلی ژنتیکی SOD1A251G ……………………………………………………………………………………………………………………..
25جدول 4-1: رابطه جنسیت و رد حاد پیوند …………………………………………………………………………30جدول 4-2: رابطه گروه خونی، RH و رد حاد پیوند ……………………………………………………………30جدول 4-3: ارتباط سن در رد پیوند کلیه ………………………………………………………………………….31جدول 4-4: فراوانی ژنوتیپی و آللی چند شکلی ژن GPX1 pro198leu درافراد سالم و بیمار ………………………………………………………………………………………………………………………………………
32جدول 4-5: آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژن GPX1 بین گروه سالم و بیماران پیوند کلیه ………………………………………………………………………………………………………………..
32جدول 4-6: فراوانی ژنوتیپی و آللی چند شکلی ژن GPX1 pro198leu درافراد فاقد ودارای رد حاد ……………………………………………………………………………………………………………………….
33جدول 4-7: آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژن GPX1 در بین گروه دارای رد حاد و فاقد رد حاد …………………………………………………………………………………………………………………
34جدول 4-8: رابطه منبع بافتی جسد و رد حاد پیوند برای ژن GPX1 …………………………….. 35جدول 4-9: فراوانی ژنوتیپی و آللی چند شکلی ژن SOD1 A252Gدرافراد سالم و بیمار ..36
جدول 4- 10: آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژن SOD1 در بین گروه سالم و بیماران پیوند کلیه ………………………………………………………………………………………………………………..
37جدول 4-11: فراوانی ژنوتیپی و آللی چند شکلی ژن SOD1 A252Gدرافراد دارای رد حاد و فاقد رد حاد …………………………………………………………………………………………………………………
38جدول 4- 12: آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژن SOD1 در بین گروه دارا و فاقد رد حاد …………………………………………………………………………………………………………………………..
39جدول 4-13: رابطه منبع بافتی جسد و رد حاد پیوند برای ژن SOD1 ……………………………40جدول 4-14: اثر همزمان چند شکلیهایGPX1 و SOD1 در افراد سالم و بیمار ………….41جدول 4-15: اثر همزمان چند شکلیهایGPX1 و SOD1 در بیماران دارا و فاقد رد حاد ………………………………………………………………………………………………………………………………………..
41جدول5-1: فراوانی آللT در جمعیتهای متفاوت ……………………………………………………………….45جدول5-2: فراوانی آلل G در جمعیتهای متفاوت …………………………………………………………….46
فهرست شکلها
عنوان صفحه
شکل 1-1- ساختار ژنتیکی گلوتاتیونپراکسیداز یک و چند شکلی ژنتیکی GPX1pro198leu ………………………………………………………………………………………………………………
9شکل 1-2- ساختار ژنتیکی سوپراکسید دسموتاز یک و چندشکلی SOD1 A251G 10شکل 3-1:نتایج حاصل از PCR -RFLPچند شکلی ژنتیکی GPX1قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز ……………………………………………………………………………………………………………………………..
26شکل 3-2:نتایج حاصل از PCR -RFLPچند شکلی ژنتیکی SOD1قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز ……………………………………………………………………………………………………………………………..
27

فصل اول

مقدمه

1-1- پیوند کلیه
پیوند به معنی جابهجا کردن سلولها، بافتها یا اندامهای انسانی از یک فرد اهداکننده به یک فرد گیرنده با هدف بازگرداندن عملکرد یا عملکردهایی به بدن است. به مجموع این سلولها، بافتها و اندامها، پیوند یا گرافت1 گفته میشود، که انواع متفاوتی دارد. پیوند از یک فرد به خودش پیوند اتولوگ2، بین افرادی یکسان از نظر ژنتیکی پیوند همژن3، بین دو فرد از یک گونه پیوند آلوژن4 و بین افرادی از گونههای متفاوت پیوند زنوژن5 گفته میشود (Abbas et al, 2011).
استفاده از روش درمانی پیوند اعضا برای بیماریهای انسانی در نیمقرن گذشته افزایش قابل توجهی داشته است. از میان اندامها قلب، کلیه، کبد، ریه، پانکراس، روده و تیموس و از میان بافتها استخوان، تاندونها، قرنیه، پوست، دریچههای قلبی، اعصاب و عروق قابل پیوند زدن هستند. به ترتیب کلیه، کبد و قلب معمولترین اندامهای پیوندی در جهان به شمار میروند. در حال حاضر پیوند کلیه، قلب، ریه، کبد، پانکراس و مغز استخوان به طور وسیعی در ایران انجام میشود.
پیوند کلیه به عنوان یک استراتژی درمانی موثر برای بیماران مبتلا به مرحله نهایی بیماری کلیوی یا ESRD 6 شناخته میشود. ESRD یکی از مشکلات بهداشت عمومی در سراسر جهان است که شیوع و بروز آن در کشورهای توسعه یافته و در حال توسعه در حال افزایش است. در این بیماری میزان فیلتراسیون گلومرولی کلیه به کمتر از ml/min 15 میرسد ( Mousavi et al, 2014 ).
تا سال 1389 جمعیت بیماران دچار نارسایی کلیه در ایران 320 هزار نفر بودهاست که از این میان 49% از روش درمانی پیوند کلیه، 48% از روش دیالیز خونی و 3% از روش دیالیز صفاقی استفاده کردهاند (Aghighi et al, 2008). تا سال 1390، 31949 مورد پیوند کلیه در ایران انجام گرفتهاست. ﻣﻴﺰان ﺑﻘﺎء ﻳﻚ ﺳﺎﻟﻪ ﭘﻴﻮﻧﺪ ﻛﻠﻴﻪ در اﻳﺮان نزدیک ﺑﻪ 7/94 درﺻﺪ ﮔـﺰارش ﺷـﺪهاﺳـﺖ (Almasi Hashiani et al, 2011). اولین پیوند کلیه در ایران در سال 1347 در بیمارستان نمازی شیراز توسط دکتر سنادیزاده انجام شد.

1-2- رد پیوند
اصلیترین علت عدم موفقیت در پیوند، پاسخ سیستم ایمنی فرد گیرنده در برابر بافت اهداشده است. چنانچه گیرنده آلوگرافت کلیه، دارای سیستم ایمنی کاملا سالمی باشد، عمل پیوند تقریبا در تمامی موارد منجر به نوعی از رد میشود. رد پیوند پرسهای با مکانیسمهای متفاوت است. آنتیبادیها، سیستم کمپلمان، سلولهای T و سایر انواع سلولی در رد پیوند دخیل هستند ( et al, 2011 Gavela Martínez). آلوآنتیژنها هر دو دسته پاسخهای ایمنی با واسطه سلولی و همورال را برمیانگیزند. با توجه به پیشینه رد پیوندهای کلیوی، الگوی هیستوپاتولوژیک رد پیوند را به سه دسته فوق حاد، حاد و مزمن طبقه بندی میکنند (Abbas et al, 2011).
1-2-1-رد فوق حاد
این شکل از رد پیوند در فاصله زمانی کوتاهی بین چند دقیقه تا چند ساعت بعد از پیوند با واسطه سیستم ایمنی هومورال اتفاق میافتد. در این شرایط تورم، ترومبوز عروقی، خونریزی و انفارکتوس در گرافت دیده میشود. این واکنشها از فعالیت آنتیبادیهای سیستم کمپلمان و سلولهای اندوتلیال گرافت ناشی شده و سرانجام باعث از دست رفتن بافت پیوندی میشوند (Al-rabia, 2009).

1-2-2-رد حاد
سلولهای T و آنتی بادیها معمولا پس از اولین هفته پیوند، باعث ایجاد نوعی آسیب عروقی و پارانشیمی میشوند که رد حاد نام میگیرد. مطالعات در سویههای خالص موش نقش محوری مولکولهای کمک تحریکی و کموکاینها را در رد حاد پیوند نشان داده است. برخی از واسطههای التهابی به عنوان مثال، IFNγ میتوانند حساسیت پیوند به آسیب را تغییر دهند (Cornell et al, 2008). از انواع مهم رد حاد پیوند میتوان به رد حاد با واسطه آنتیبادیها و رد حاد با واسطه سلولهای T اشاره کرد.
رد حاد با واسطه آنتیبادی اغلب از چند روز تا چند هفته پس از پیوند آغاز میشود. اولین نشانه در این نوع از رد پیوند اختلال سریع در عملکرد گرافت ناشی از التهاب است. با عملکرد آنتیبادیهایی که از قبل در بدن وجود دارند، فعالیت سیستم کمپلمان بر علیه گرافت آغاز میشود. هدف اصلی این آنتیبادیها7 MHC های سطحی سلولهای اندوتلیال و مویرگهای گلومرولی گرافت هستند(Nankivell et al, 2010).
رد حاد سلولی با تجمع سلولهای تک هستهای در فضای میان بافتی و التهاب شریانها و توبولها مشخص میشود. اکثر سلولهای تک هستهای که در فضای میان بافتی در اطراف توبولها نفوذ میکنند، سلولهای T CD4+ و CD8 + هستند. رد حاد سلولی باعث یک افزایش ناگهانی در کراتینین سرم، احتباس مایعات و گاهی اوقات تب و حساسیت پیوند میشود. با درمانهای فعلی، بروز رد حاد حدود 5 تا 10 درصد در سال اول در بیماران کاهش مییابد (Cornell et al, 2008).

1-2-3- رد مزمن
در پیوندهای دارای عروق که بیش از شش ماه باقی ماندهاند با تکثیر سلولهای عضلانی صاف، انسداد شریانی به آرامی گسترش مییابد و در نهایت موجب آسیب ایسکمیک و رد پیوند میشود. از ویژگیهای این نوع رد پیوند کاهش پیشرونده عملکرد کلیوی، حمله به پارانشیم کلیه توسط سلول های T و نفوذ مداوم مایعات میان بافتی توسط سلول های T و ماکروفاژها است (Cornell et al, 2008). رد مزمن در بافتهای مختلف شواهد فیزیولوژیکی گوناگونی را نشان میدهد.
1-3- پیشگیری از رد آلوگرافت
استراتژیهایی جهت جلوگیری از رد پیوند، بهبود بخشیدن به عمکرد آن و بالا بردن کیفیت زندگی گیرنده پیوند شامل سرکوب سیستم ایمنی، القاء تحمل اختصاصیدهنده، سنجش سازگاری8 HLA، ردیابی وجود آنتیبادیهای تولید شده از پیش، سازگاری متقاطع9 و تعیین گروه خونی ABO امروزه به کار برده میشوند.
سرکوب سیستم ایمنی را میتوان با تخلیه، انحراف ترافیک و مسدود کردن مسیر پاسخ لنفوسیتها اعمال کرد. داروهای سرکوبگر سیستم ایمنی شامل داروهای کوچک ملکول، داروهای کاهنده و غیرکاهنده پروتئینی، داروهای ترکیب شونده با پروتئینها، گلوبولینهای ایمنی داخل وریدی و گلکوکورتکوییدها هستند. این داروها سه اثر عمده شامل اثر درمانی (سرکوب رد)، پیامدهای ناخواسته از نقص ایمنی (افزایش عفونت و یا سرطان)​​ و سمیت غیرایمنی در بافتهای دیگر را دارند ( Halloran, 2004). داروهای سرکوبگر سیستم ایمنی که عمل آنها مهار یا نابود کردن لنفوسیتهای T است، به عنوان رژیم درمانی اصلی برای رد پیوند استفاده میشوند (Abbas et al, 2011).
در حال حاضر مهمترین داروهای بالینی سرکوبکننده ایمنی، مهارکنندههای کلسینورین شامل سایکلوسپورین و FK-506 (تاکرولیموس) هستندکه نسخه برداری برخی ژنها در لنفوسیتهای T را مهار میکنند. مایکوفنولاتمفتیل، آزاتیوپرین و راپامایسین نیز از سایر داروهای مهم سرکوبگر سیستم ایمنی هستند. خوشبختانه در سالهای اخیر شیوع عفونت و سرطان ناشی از مصرف داروهای سرکوب کننده سیستم ایمنی کاهش یافته است که شاید به دلیل جلوگیری از رد پیوند با استفاده از مدیریتهای پیش از عمل باشد (Halloran, 2004).
در پیوند اعضا با هدف تطابق بیشتر بین دو فرد دهنده و گیرنده گرافت، سعی بر آن است که از تعداد موارد تفاوت در آللهای HLA بارز شده بر سطح سلولها کاسته شود. به طور معمول آزمایش HLA تنها در مورد HLA-A، HLA-B و HLA-DR صورت میگیرد برای تعیین هاپلوتایپهای HLA از دو روش سرولوژیک و ملکولی استفاده میشود. اساس روش سرولوژیک استفاده از سرم افرادی که از قبل در معرض HLAهای متفاوت قرار داشتهاند، به عنوان سرم استاندارد است و اساس روش ملکولی استفاده از تکنیک10 PCR است (Mahdi, 2013).
بررسی تطابق گروههای خونی ABO در گیرنده و دهنده پیوند ضروری و متداول است. در صورت وجود ناسازگاری در این زمینه هیچ شانسی برای بقاء پیوند وجود ندارد. در صورت عدم تطابق جزئی گروههای خونی از روشهای گوناگونی از جمله اندازهگیری میزان آنتیبادی، کاستن از میزان سلولهای B فعال و کاستن از میزان آنتیبادی سرمی استفاده میشود (Muramatsu et al, 2014).
گیرندگان پیوند از نظر وجود آنتیبادیهایی که از قبل به دلایل متفاوت از جمله انتقال خون، پیوندهای پیشین و بارداری در بدن آنها وجود دارند، غربال میشوند. استفاده از روشهای سیتوتوکسیک، فلوسایتومتری و سرولوژیک در این غربالگری معمول است که در تشخیص رد فوق حاد و حاد عروقی کاربرد دارند (Abbas et al, 2011). چنانچه آزمایشها بر علیه سرم افراد گوناگون انجام شود، ردیابی وجود آنتیبادی تولید شده از پیش و چنانچه بر علیه سرم اهداکننده خاص انجام شده باشد، سازگاری متقاطع گفته میشود (Qureshi, 1997).
سایر عوامل دخیل در رد پیوند شامل سن، جنس، نژاد، اعتیاد و سابقه بیماریهای پیشین در گیرنده و دهنده پیوند، توده بدنی و سابقه رد پیوند فرد گیرنده، زنده یا جسد بودن فرد اهداکننده پیوند و غیره است. مطالعات پیشین به خصوص در مورد پیوند کلیه حاکی از آناند که بهترین بازه سنی برای اهدا کنندگان بین بیست تا چهل سال و برای دریافت کنندگان بین چهل تا شصت سال است. احتمال رد پیوند در گیرندگان بالای هفتاد سال افزایش مییابد (Almasi Hashiani et al, 2011).
بر اساس مشاهدات، نژاد سفید پوست در مقایسه با آمریکاییهای آفریقایی تبار شانس بقاء پیوند بالاتری را نشان میدهند. از نظر جنسیت نیز موفقیت پیوند کلیه در مردان بالاتر است. پیوند از فرد زنده به خصوص خویشاوند نسبت به فرد مرگ مغزی نتایج بهتری را نشان میدهد.
چنانچه گیرنده آلوگرافت کلیه دچار دیابت، بیماریهای قلبی و عروقی به خصوص تصلب شرایین، سندرم گودپاسچر، هپاتیت و بیماریهای روانی باشد، فقط در صورت درمان، عمل پیوند انجام میگیرد. وجود HIV11 در فرد اهداکننده و گیرنده از موارد منع پیوند محسوب میشود. در صورتی که فرد گیرنده سابقه رد پیوند را در کارنامه خود داشته باشد، عمل پیوند با دقت بیشتری انجام میشود.

1-4-استرس اکسیداتیو
گونههای فعال اکسیژنی (ROS12) از جمله سوپراکسیدها، هیدروژن پراکسیدها و رادیکالهای هیدروکسیل به طور طبیعی در تمام ارگانیسمهای هوازی تولید شده و در تعادل با آنتیاکسیدانها قرار دارند. استرس اکسیداتیو زمانی اتفاق میافتد که این توازن حیاتی به دلیل کاهش آنتیاکسیدانها، افزایش ROSها و یا هر دو برهم خورد (Scandalios, 2002).
استرس اکسیداتیو در پاتوژنز بسیاری از بیماریها از جمله تصلب شرایین، فشار خون بالا، دیابت، بیماریهای ایسکمیک، و سرطان نقش دارد. به دلیل حمله رادیکالهای آزاد اکسیژن به مولکولهای زیستی مانند چربیها، پروتئینها و DNA استرس اکسیداتیو خطرناک محسوب میشود (Yoshikawa et al, 2002). در این شرایط تمامی ارگانیسمها با بالا بردن القاء تولید آنزیمهای آنتیاکسیدان دفاعی سعی بر سازگاری با شرایط و برقراری دوباره توازن را خواهند داشت (Scandalios, 2002). برای حفظ تعادل و جلوگیری از خطرات ناشی از ROSها، سلولها از دو مسیر دفاعی آنزیمی و غیرآنزیمی استفاده میکنند. مسیر غیرآنزیمی با استفاده از ویتامینهای C و E، گلوتاتیون، یوریکاسید، یوبیکوئینن، لیپوئیکاسید و کاروتینوئیدها و مسیر آنزیمی با عمل سوپراکسیددسموتازها، گلوتاتیون پراکسیدازها، کوئینوناکسیدوردوکتازها، کاتالاز، میلوپراکسیداز و غیره عمل میکنند.

1-5-گلوتاتیون پراکسیداز 1 (GPX1)
گلوتاتیون پراکسیدازها خانوادهای آنزیمی با فعالیت پراکسیدازی هستند که نقش اصلی آنها محافظت ارگانیسمها در برابر استرسهای اکسیداتیو است. این خانواده دارای هشت ایزومر است که به ترتیب با اعداد یک تا هشت نامگذاری میشوند (GPX1-8). ژن گلوتاتیون پراکسیداز یک انسانی (hGPX1) یکی از اعضای این خانواده است. این ژن در موقعیت کروموزومی3p21.31 قرار گرفته و طول آن kb 424/1 (49394609 – 49396033) است. از روی این ژن دو ایزوفرم mRNA متفاوت کد میشوند ( nextprot association nom: NX_ P07203) ( et al, 2000 Ratnasinghe ). ایزوفرم یک دارای یک اینترون و دو اگزون است که چند شکلی مورد مطالعه بر روی اگزون دوم آن قرار دارد.
ژن گلوتاتیون پراکسیداز1 یکی از مهمترین آنزیمهای آنتیاکسیدان درون سلولی را کد میکند که در سیتوزول، میتوکندری و بعضا پروکسیزوم یافت میشود. عملکرد این آنزیم سمزدایی پراکسید هیدروژن و کاهش اثرات مضر آن در بدن است. آنزیم GPX1 در بسیاری از شرایط فیزیولوژیک از کاتالاز موثرتر عمل میکند. این پروتئین از معدود پروتئینهای مهرهداران عالی است که حاوی سلنیوم به فرم سلنیوسیستئین در جایگاه فعال خود است ( Lubos et al, 2011وRatnasinghe et al, 2000 ).
واکنش اصلی کاتالیز شده توسط گلوتاتیونپراکسیداز به شکل زیر است:
2GSH + H2O2 → GS–SG + 2H2O
در این واکنش با تبدیل دو گلوتاتیون احیاء به گلوتاتیون دیسولفید با واسطه گلوتاتیونپراکسیداز، H2O2 سمزدایی میشود. سلنیوم حاضر در جایگاه فعال آنزیم در ابتدا در واکنش با پراکسیدهیدروژن اکسید شده، سپس آنزیم با گلوتاتیون اول وارد واکنش میشود و یک ملکول آب و GS-SER تولید میکند. در نهایت با ورود گلوتاتیون دوم GS-GS تشکیل شده و آنزیم بازیافت میشود.
RSeH + H2O2 → RSeOH + H2O
RSeOH + GSH → GS-SeR + H2O
GS-SeR + GSH → GS-SG + RSeH
گلوتاتیون اکسید شده سرانجام توسط واکنش زیر و با فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز احیا میشود:
GS–SG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP+

فعالیت آنزیمی گلوتاتیون پراکسیداز یک تحت تاثیر جایگزینی نوکلئوتید T به جای نوکلئوتید C در موقعیت کدون 198 (rs1050450) این ژن کاهش مییابد. در این چند شکلی اسید آمینه لوسین جایگزین پرولین میشود (Lubos et al, 2011). مطالعات بسیاری رابطه این چند شکلی با احتمال ابتلا به انواع مختلفی از بیماریها را نشان میدهند (Ratnasinghe et al, 2000 و et al, 1988 Nève).

شکل 1-1- ساختار ژنتیکی گلوتاتیونپراکسیداز یک و چند شکلی ژنتیکی GPX1pro198leu

1-6- سوپراکسیددسموتاز1 (SOD1)
سوپراکسیددسموتاز خانوادهای آنزیمی است که به عنوان اولین و مهمترین سد دفاع آنتیاکسیدانی در برابر ROSها شناخته میشود. تا کنون سه ایزوفرم از این آنزیم در پستانداران شناسایی شده است، SOD1 یا Cu/Zn-SOD13 ، SOD2 یا 14 Mn-SOD و 15SOD3 یا EC-SOD. SOD1 برخلاف SOD2 و SOD3 دایمر است و در سیتوپلاسم فعالیت میکند (Kim C H, 2013). ژن سوپراکسید دسموتاز یک یا کوپر/ زینک سوپراکسید دسموتاز با طول kb 309/9 ( 31668930 – 31659621) دارای پنج اگزون و چهار اینترون است که در موقعیت کروموزومی 21q22.11 قرار گرفتهاست (genetic home reference/gene/SOD1) (Kase et al, 2012).
آنزیم کوپر/زینک سوپراکسید دسموتاز یک آنزیم عمدتا سیتوزولی است که مسئول سمزدایی گونههای فعال اکسیژن طبق واکنش زیر است:
M(n+1)+-SOD + O2− → Mn+-SOD + O2
Mn+-SOD + O2− + 2H+ → M(n+1)+-SOD + H2O2

این آنزیم که حاوی مس و روی است که در فرم اکسید شدهی خود با یک یون سوپراکسید واکنش داده و اکسیژن تولید میکند. سپس فرم احیا ایجاد شده با سوپراکسید دوم وارد واکنش شده و هیدروژن پراکسید تولید میکند. پس از آن آنزیم دوباره بازیافت شده و به فرم اکسید درمیآید. در این واکنش M میتواند نیکل، آهن، منگنز یا مس باشد.
در صورت ایجاد جهش در ساختار این ژن و یا عدم تا شدن صحیح پروتئین آن، در مسیر سمزدایی اختلال ایجاد میشود. در همین راستا جایگزینی نوکلئوتید حاوی گوانین در جایگاه 251 (rs2070424) در اینترون سه این ژن به جای نوکلئوتید حاوی آدنین میتواند احتمال ابتلا به برخی بیماریها را افزایش دهد Zhang et al, 2011) و et al, 2009 Seetharaman).
rs2070424

شکل 1-2- ساختار ژنتیکی سوپراکسید دسموتاز یک و چندشکلی SOD1 A251G
1-7- هدف
استرس اکسیداتیو فرآیندی است که با افزایش در گونههای فعال اکسیژنی و یا کاهش فعالیت آنتیاکسیدانها شناخته میشود. تجمع گونههای فعال اکسیژنی (ROS) نقش مهمی در ایجاد بسیاری از بیماریها از جمله انواع سرطان، دیابت، آلزایمر، بیماریهای قلبی (16CVD)، بیماری مزمن کلیوی 17(CKD) و ALS18 ایفا میکند. آنزیمهای گلوتاتیون پراکسیداز و سوپراکسید دسموتاز از جمله آنزیمهایی هستند که در جهت سمزدایی و غیر فعالکردن این ترکیبات عمل میکنند (Crawford et al, 2011، Crawford et al, 2012 وKase et al, 2012). در این مطالعه بر آن شدیم تا ارتباط چند شکلیهای pro198leu ژن گلوتاتیون پر اکسیداز یک و A251G ژن سوپراکسید دسموتاز یک با خطر رد حاد در بیماران دریافت کننده پیوند کلیه را مورد بررسی قرار دهیم.

1-8- فرضیه
ژن GPX1 pro198leu:
ژنوتیپهای TT و TC نسبت به ژنوتیپ CC در چند شکلی GPX1 pro198leu خطر رد حاد پیوند کلیه را افزایش میدهند.
با افزایش آلل T در چند شکلی GPX1 pro198leu خطر رد حاد پیوند کلیه افزایش مییابد.
ژن SOD1 A251G:
ژنوتیپهای GG و AG نسبت به ژتوتیپ AA در چند شکلی SOD1 A251G خطر رد حاد پیوند کلیه را افزایش میدهند.
با افزایش آلل G در چند شکلی SOD1 A251G خطر رد حاد پیوند کلیه افزایش مییابد.

فصل دوم

مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1- مطالعات انجام شده بر روی چند شکلی GPX1 pro198leu و ارتباط آن با بیماریهای گوناگون
در مطالعهای که توسط Ye و همکارانش در سال 2013 انجام شد، رابطه دوازده چند شکلی ژنهای متفاوت از جمله GPX1 pro198leu با بیماریهای کرونری قلب مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این متاآنالیز ارتباط چند شکلیC/T GPX1با استعداد ابتلا به بیماری عروق کرونری قلب (CHD)19 در جمعیت چین و هند را با OR برابر 61/1 برای آلل T تایید میکند (Ye et al, 2013).
پژوهشی در سال 2013 توسط Huang و همکارانش در تبت بر روی ارتباط چندشکلیهای متفاوت از ژنهای سلنوپروتئین با20 KBD و غلظت سرمی سلنیوم/ید انجام شد. نتایج نشان میدهند که هاپلوتایپهای TCC، TTC، TTT از سه چندشکلی GPX1 با rs1050450، rs1800668 و rs3811699 ارتباط معناداری با KBD دارند. علاوه بر این، چندشکلی ژنGPX1 (rs1050450) ممکن است به طور قابل توجهی با غلظت ید در تبتیها ارتباط داشته باشد (Huang et al, 2013).
Hong و همکارانش در سال 2013، چندشکلی ژن GPX1 (rs1050450) و احتمال خطر ابتلا به سرطان را در متاآنالیزی مورد بررسی قرار دادند. نتایج این مطالعه ارتباط قابل توجهی از چندشکلی مورد بررسی در این ژن با خطر ابتلا به سرطان را نشان نمیدهد (Hong et al, 2013).
در سال 2014 مطالعهای توسط Oskinaو همکارانش در ناحیه سیبری روسیه بر روی چندشکلیGPX1 pro198leu و ارتباط آن با سرطان پروستات صورت گرفت. در این مطالعه ارتباط معناداری مشاهده نشد (Osakina et al, 2014).
متاآنالیزی به کوشش Zhang و همکارانش در سال 2014 در مورد ارتباط چند شکلی GPX1 pro198leu با بیماریهای قلبی و عروقی به چاپ رسید. در این مطالعه افزایش قابل توجه خطر ابتلا به CVD با OR مساوی 84/1 در حضور لوسین در این جایگاه دیده شد (Zhang et al, 2014).

2-2- مطالعات انجام شده بر روی چند شکلی SOD1 A251G و ارتباط آن با بیماریهای گوناگون
در سال 2006 Oestergaard و همکارانش احتمال ابتلا به سرطان سینه را با 25 چندشکلی از 10 ژن از اعضا سیستم دفاع آنتیاکسیدانی در جمعیت انگلستان مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه ارتباط معناداری بین چند شکلی SOD1 A251G و سرطان سینه مشاهده نشد (Oestergaard et al, 2006).
پژوهشی در سال 2008 توسط Rajaraman و همکارانش بر روی چند شکلیهای ژنتیکی ژنهای مرتبط با استرسهای اکسیداتیو (CAT, GPX1, NOS3, PON1, SOD1, SOD2 & SOD3) و ایجاد تومور مغزی در بزگسالان انجام شد. در این پژوهش رابطه معناداری بین چند شکلیهای SOD1 A251G و GPX1 pro198leu و ابتلا به تومور مغزی در بزرگسالان مشاهده نشد (Rajaraman et al, 2008).
در سال 2010 مطالعهای توسط Liu و همکارانش بر روی ارتباط چندشکلیهای ژن SOD1 و از دست دادن شنوایی ناشی از صدا در کارگران چینی انجام شد. نتایج این مطالعه اثر حفاظتی ژنوتیپ AA را با 45/0OR= نشان میدهد (Liu et al, 2010).
مطالعهای در سال 2011 بر روی چند شکلیهای متفاوت ژن SOD1 و خطر ابتلا به NIHL21 در جمعیت هان توسط Li و همکارانش انجام شد. در این پژوهش الل G از چند شکلی A251G این ژن احتمال ابتلا به NIHL را افزایش میدهد (67/0OR=) (Li et al, 2011).
در سال 2011 مطالعهای بر روی چند شکلیهای 251A/G ژن سوپر اکسید دسموتاز، 21A/T- ژن کاتالاز و pro198leu ژن گلوتاتیون پراکسیداز و ارتباط آنها با آب مروارید وابسته به سن، توسط Zhang و همکارانش انجام شد. نتایج نشان میدهند که هیچ تفاوت قابل توجهی در بیماران نسبت به گروه کنترل برای چند شکلی GPX1 pro198leu وجود ندارد. این در حالی است که ژنوتیپ GG در چند شکلی SOD1 A251G باعث افزایش خطر ابتلا به آب مروارید وابسته به سن با OR مساوی 64/1 میشود (Zhang et al, 2011).
مطالعه دیگری توسط Kase و همکارانش در سال 2012 بر روی چند شکلی A251G ژن SOD1 و اثر آن بر nonsyndromic myelomeningocele صورت گرفت. نتایج این پژوهش نشان دهنده اثر حفاظتی الل G با OR برابر 66/0 بر روی استعداد ابتلا به این بیماری است (Kase et al, 2012).
در سال 2012 Zeng و همکارانش مطالعهای بر روی ارتباط میان چندشکلی SOD1 A251G و NIHLدر دو گروه ( به ترتیب در معرض 92-85 و بیش از 82 دسیبل) انجام دادند. نتیجه این مطالعه نشان دهنده اثر محافظتی ژنوتیپ AA به ترتیب با OR، 37/0 و 25/0 در این دو گروه است (Zeng et al, 2012).

2-3- مطالعات انجام شده بر روی رد حاد پیوند کلیه
پژوهشی در سال 2013 توسط Kim و همکارانش بر روی ارتباط چندشکلی TGFBR2 Asn389Asn (rs2228048) و رد حاد پیوند کلیه در کره انجام شد. در این مطالعه ارتباط معناداری بین این چند شکلی و افزایش ریسک رد حاد پیوند کلیه مشاهده شد(026/0 p=) (Kim et al, 2013).
در سال 2013 مطالعهای توسط Misra و همکارانش بر روی ارتباط رد حاد پیوند کلیه و ESRD با حذف و اضافه چهارده جفت باز در پروموتر ژن HLA-G صورت گرفت. در این مطالعه ارتباطی معنادار بین این چند شکلی و رد حاد پیوند کلیه و ابتلا به ESRD مشاهده شد به طوری که در بیماران فاقد رد حاد پیوند نسبت به افراد دارای رد حاد سطح بالاتری از HLA-G محلول دیده میشود (Misra et al, 2013).
مطالعهای توسط Mandegary و همکارانش بر روی اثر ژنوتیپ ژنهای TNF-α22 و IL-1023 فرد اهدا کننده با عملکرد تاخیری گرافت24 و رد حاد پیوند کلیه در سال 2013 صورت گرفت. در این مطالعه میان آلل A از چندشکلی TNF -308G>A  با OR برابر 1/3 و DGF ارتباط معناداری مشاهده شد. نتایج نشان داد که اهدا کنندگان با تولید TNF بالا ممکن است خطر DGF در دریافت کنندگان را افزایش دهند (Mandegary et al, 2013).
پژوهشی توسط نکویی و همکارانش در سال 2013 در شیراز بر روی چندشکلی ژنتیکی GSTO2 (N142D) و خطر رد حاد پیوند کلیه انجام شد. در این مطالعه ارتباط معناداری میان این چندشکلی با ESRD و رد حاد پیوند کلیه مشاهده نشد. با این حال طبق نتایج این مطالعه، ژنوتیپ DD در بیمارانی که پیوند از اهداکننده جسد بر روی آنها صورت گرفته بود با 82/3OR= احتمال رد حاد پیوند کلیه را افزایش میدهد (Nekooie-Marnany et al, 2013).
Pawlik و همکارانش در سال 2014 مطالعهای برای یافتن ارتباط رد حاد پیوند کلیه و چندشکلی ژنتیکی IVS3 +17T/C CD28 انجام دادند. این مطالعه ارتباط معناداری بین چندشکلی IVS3 +17T/C در ژن CD28 و رد حاد پیوند کلیه را نشان داد، به طوری که OR، CC+CT در مقابل TT برابر 93/1 بود (Pawlik et al, 2014).
در سال 2014 Chen و همکارانش پژوهشی در زمینه ارتباط رد حاد پیوند کلیه و چند شکلیهای ژنتیکی در ژنهای IL-2، IL-10، IL-2RB و TGF-β1 انجام دادند. میان این چند شکلیها و خطر رد حاد پیوند کلیه ارتباط معناداری مشاهده نشد (Chen et al, 2014).

فصل سوم

مواد و روش انجام کار

3-1-نمونه گیری
این مطالعه بر روی 262 بیمار پیوند کلیه از مرکز پیوند اعضا بیمارستان نمازی شیراز در سالهای 1390، 1391 و 1392 انجام شد. تمامی نمونهها به صورت خون کامل جمعآوری شده و در تیوبهای حاوی EDTA در شرایط دمایی چهار درجه سانتیگراد به آزمایشگاه انتقال داده شدند. در این طرح تعداد 262 نمونه کنترل از پایگاه انتقال خون شیراز جمع آوری و طبق شرایط گفته شد به آزمایشگاه منتقل گردید. افراد سالم از نظر میانگین سنی و فراوانی جنسی با بیماران مطابقت داده شدند. رضایتنامه از بیماران و افراد سالم اخذ و انجام این مطالعه توسط کمیته اخلاق دانشگاه شیراز تایید شدهاست. در این پژوهش یک مطالعه مورد-شاهدی بین افراد سالم و بیماران پیوند کلیه و یک مطالعه بین بیماران پیوندی دچار عارضه رد حاد و فاقد رد حاد انجام شد. رد حاد در طول 6 ماه اول پس از پیوند با انجام بیوپسی (نمونه برداری از بافت) تایید میشود (Finkelstein et al, 1976).

جدول3-1: مشخصات افراد مورد مطالعه
بیماران پیوندیکنترلتعداد کل262262میانگین سنی2/14±3/426/13±9/42

3-2-وسایل مورد استفاده
وسایل استفاده شده در این مطالعه عبارتند از:
• سمپلر (ساخت Brand, Socorex )
• ترازو
• Rotator (ساخت پدیده نوژن پارس)
• میکروسانتریفیوژ (ساخت Hettich)
• Vortex (ساخت Scientific industries INC)
• Spine down
• دستگاه PCR (ساخت Techne)
• انکوباتور
• تانک الکتروفورز و منبع تغذیه جریان الکتریکی (ساخت پایا پژوهش)
• دستگاه Gel Documentation (ساخت Uvitec Cambridge)
• اتوکلاو (ساخت ریحان طب)
• ماکروفر (ساخت بوتان)
3-3-مواد مورد استفاده
3-3-1: محلولهای لازم جهت استخراج DNA
• محلول NH4Cl (170 میلیمولار)
• محلول NaCl-EDTA (10 میلیمولار)
• محلول NaOH (50 میلیمولار)
• محلول Tris-HCl (1مولار)
3-3-2: مواد استفاده شده جهت انجام PCR
• بافر 10X (10X Buffer)
• MgCl2
• پرایمرهای رفت و برگشت برای ژنهای GPX1 و SOD1
• dNTP
• Taq Polymerase
همگی ساخت سینا ژن
3-3-3: مواد استفاده شده جهت انجام الکتروفورز
• بافر TBE (X 5/0)
• Agarose (ساخت Invitrogen)
• 6X Loading Buffer (سینا ژن)
• محلول اتیدیم برماید (X 1000)
• DNA Ladder 100bp (Vivantis)
• Boric acid (Merck)
• Tris base (Merck)
• EDTA (Merck)
3-3-4: مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزیم محدود کننده
• آنزیمهای محدود کننده ApaI و MspI (ساخت Fermantas )
• B Buffer برای آنزیم ApaI
• Tango Buffer برای آنزیم MspI
3-4- استخراج DNA به روش جوشاندن (Boiling)
3-4-1: ساخت محلولهای مورد نیاز جهت استخراج
• برای ساخت محلول NH4Cl(170 میلیمولار) 1/0گرم NH4Cl را در 10 سیسی آب استریل حل شده و بلافاصله استفاده مورد استفاده قرار میگیرد.
• در تهیه محلول NaCl-EDTA (10 میلیمولار) 9/0 گرم EDTA و 146/0 گرم NaCl مورد نیاز هستند که در 250 میلیلیتر آب مقطر حل شده و pH آن به 5/7 رسانده میشود. این محلول پیش از استفاده باید اتوکلاو گردد.
• محلول NaOH (50 میلیمولار) از 5/0 گرم NaOH در 250 میلیلیتر آب مقطر تهیه شده و پیش از استفاده اتوکلاو شد.
• برای ساخت محلول Tris-HCl (یک مولار) 94/3 گرم Tris-HCl در 25 میلیلیتر آب مقطر حل شده و pH آن به 5/7 رسانده شد. این محلول نیز پیش از استفاده اتوکلاو گردید.
3-4-2: فرآیند استخراج به روش جوشاندن
فرآیند استخراج توسط محلولهای تهیه شده و با استفاده از 200 میکرولیتر خون براساس روش ارائه شده در منبع انجام شد (Newton, 1995 ).
3-5- تعیین ژنوتیپ با روش PCR-RFLP25
3-5-1: PCR
از واکنش زنجیرهای پلیمراز یا PCR جهت تعیین ژنوتیپ چندشکلیهای ژنتیکی ژنهای GPX1pro198leu و SOD1A251G استفاده شد. در جدول 1 شرح مواد مورد نیاز برای انجام یک واکنش PCR آمده است. به منظور انجام PCR ابتدا تمامی اجزا گفته شده در جدول به جز Taq polymerase از فریزر 20- درجه سانتی گراد خارج و در دمای اتاق قرار داده میشوند..
پس از ذوب شدن، تمامی اجزاء ورتکس شده و به یخ چهار درجه سانتیگراد برای انجام سایر مراحل انتقال داده میشوند. پس از اضافه شدن DNA الگو تیوبها توسط دستگاه، spin down شده و در دستگاه PCR قرار داده میشوند.

جدول 3-2: مواد مورد نیاز برای انجام PCR
اجزاء واکنشمیزان مورد نیاز برای هر واکنش (میکرولیتر)10x buffer5/2MgCl2 (50 mM)75/0Forward primer (10 μM)1Reverse primer (10 μM)1dNTP (10mM)5/0Taq polymerase3/0آب استریل95/13الگو DNA5
پرایمر رفت و برگشت، هر کدام برای انجام واکنش PCR ژن GPX1pro198leu به ازاء هر نمونه 6/0 میکرولیتر استفاده شده است. به همان نسبت میزان آب استریل برای هر نمونه به 75/14 میکرولیتر میرسد.

3-5-2: پرایمرهای مورد استفاده
• پرایمر برای ژن GPX1:
Forward primer: 5′-AAGGTGTTCCTCCCTCGTAGGT-3′
Reverse primer: 5′- CTACGCAGGTACAGCCGCCGCT-3′
)Paz-y-Miño et al, 2010(
• پرایمر برای ژن SOD1:
Forward primer: 5′-AGTACTGTCAACCACTAGC-3′
Reverse primer: 5′- ACAGCTCTTCAAACAAGGC-3′
(طراحی شده در آزمایشگاه)
3-6- تعیین ژنوتیپ برای چند شکلی GPX1pro198leu
به منظور تعیین ژنوتیپ این ژن از برنامه PCR طبق جدول 3-3 استفاده شد.
جدول3-3: برنامه تنظیم شده PCR برای تکثیر ژن GPX1 در 26 سیکل
مرحلهدما (°C)زمان (ثانیه)دناتوراسیون اولیه94300دناتوراسیون9460اتصال6060طویل شدن7260بسط نهایی72540
پس از اتمام PCR به هشت میکرولیتر از محصول آن 6/0 (U6) میکرولیتر آنزیم محدود کننده ApaI، 2 میکرولیتر B buffer و 4/17 میکرولیتر آب استریل اضافه شد. تیوبها به مدت سه ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پس از آن تیوبها اسپین شده و الکتروفورز انجام میشود.
محصول PCR برای چند شکلی ژنتیکی GPX1pro198leu یک قطعه به طول 191 جفتباز است که فرم وحشی آن (ژنوتیپ CC) توسط آنزیم محدود کننده برش میخورد. پس از هضم آنزیمی قطعات 117 و 74 جفت بازی متعلق به ژنوتیپ CC، قطعات 191 جفت بازی نمایانگر ژنوتیپ TT و قطعات 191، 117 و 74 جفت بازی نشاندهنده ژنوتیپ CT هستند (جدول 3-4).
جدول3-4: قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های
چندشکلی ژنتیکی GPX1pro198leu
ژنوتیپقطعات (جفت باز)CC74، 117CT74، 117، 191TT191
3-7- تعیین ژنوتیپ برای چند شکلی SOD1A251G
به منظور تعیین ژنوتیپ این ژن از برنامه PCR طبق جدول 3-5 استفاده شد.
جدول3-5: برنامه تنظیم شده PCR برای تکثیر ژن SOD1 در 30 سیکل
مرحلهدما (°C)زمان (ثانیه)دناتوراسیون اولیه95300دناتوراسیون9430اتصال5430طویل شدن7230بسط نهایی72300
پس از اتمام PCR به ده میکرولیتر از محصول آن 5/0 (U5) میکرولیتر آنزیم محدود کننده MspI، 2 میکرولیتر Tango buffer و 5/17 میکرولیتر آب استریل اضافه گردید. تیوبها به مدت شانزده و نیم ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پس از آن به منظور جمعآوری قطرات از دیواره، تیوبها اسپین شدند.
محصول PCR برای چند شکلی ژنتیکیA251G SOD1 یک قطعه به طول 327 جفتباز است که فرم جهشیافته آن (ژنوتیپ GG) توسط آنزیم محدود کننده برش میخورد. پس از هضم آنزیمی قطعات 327 جفت بازی متعلق به ژنوتیپ AA، قطعات 126 و 201 جفت بازی نمایانگر ژنوتیپ GG و قطعات 327، 201 و 126 جفت بازی نشاندهنده ژنوتیپ AG هستند (جدول 3-6). پس از طی این مراحل برای ژن SOD1، تعیین ژنوتیپ یک نمونه از 262 بیمار حاضر در مطالعه و تعداد سه نمونه از 262 نمونه شاهد با موفقیت انجام نشد.

جدول3-6: قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های
چندشکلی ژنتیکی SOD1A251G
ژنوتیپقطعات (جفت باز)AA327AG327، 201، 126GG201، 126
3-8- الکتروفورز
در این مطالعه به منظور تعیین الگوی ژنوتیپی چند شکلیهای GPX1pro198leu و A251G SOD1 الکتروفورز بر روی ژل آگاروز 5/1 درصد صورت گرفت. بسته به حجم سینی ژل پود آگاروز در بافر TBE 5/0 درصد حل شده و به ماکروفر انتقال داده میشود تا آگاروز کاملا در بافر حل شود. پس از رسیدن به دمای تقریبی 50 درجه سانتیگراد ژل داخل سینی ریخته شده و شانه مناسب درون آن قرار داده میشود.
پس از سرد شدن کامل و خارج کردن شانه، ژل درون تانک الکتروفورز حاوی بافر TBE 5/0 درصد به طوری که کاملا زیر بافر باشد قرار گرفت. در این مرحله محصولات هضم آنزیمی پس از مخلوط شدن با 6X Loding buffer توسط سمپلر درون چاهکها لود شدند. 100bp DNA ladder نیز برای تعیین سایز قطعات درون یکی از چاهکها ریخته شد. در نهایت دستگاه به منبع جریان الکتریکی متصل شده و DNA در ژل شروع به حرکت از قطب منفی به سمت قطب مثبت میکند.
3-9- رنگآمیزی ژل
پس از اتمام الکتروفورز، ژل به منظور مشاهده قطعات DNA توسط تاباندن اشعه فرابنفش به مدت 10 دقیقه درون محلول اتیدیوم بروماید (µg/ml1) قرار گرفت. بعد از رنگآمیزی ژل، توسط دستگاه Gel documentation عکس برداری از آن صورت گرفت.

شکل 3-1:نتایج حاصل از PCR -RFLPچند شکلی ژنتیکی GPX1
قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز

شکل 3-2:نتایج حاصل از PCR -RFLPچند شکلی ژنتیکی SOD1
قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز
3-10-تحلیل آماری
در نهایت نتایج حاصل از مطالعه توسط نرمافزار آماری SPSS و با به کارگیری روش کای اسکور (x2)، آنالیز آماری رگرسیون لوجستیک و آزمون t-test با در نظر گرفتن سطح معنیداری ٠٥/٠P< مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

فصل چهارم

نتایج

4-1- مشخصات افراد شرکت کننده در این پژوهش
در این مطالعه 524 نفر شامل 262 بیمار دریافت کننده آلوگرافت کلیه و 262 فرد سالم به عنوان گروه کنترل مورد بررسی قرار گرفتهاند. میانگین سنی گروه کنترل 6/13±9/42 و میانگین سنی بیماران 2/14±3/42 است که با P-value مساوی با 517/0 اختلاف معناداری را نشان نمیدهند. از میان بیماران، 46 مورد رد حاد پیوند کلیه با میانگین سنی 5/15±3/43 دیده شدند که اختلاف معناداری با گروه فاقد رد حاد با میانگین سنی 9/13 ±1/42 را نشان نمیدهند (267/0P=).

4-2- بررسی عوامل خطر دخیل در رد حاد پیوند کلیه
عوامل خطر متعددی میتوانند در رد حاد پیوند کلیه دخیل باشند. در این مطالعه جنسیت افراد دریافت کننده و اهدا کننده پیوند، گروه خونی و RH دریافت کنندگان، منبع بافتی و سن به عنوان عوامل خطر در نظر گرفته شدند. به منظور بررسی نقش این عوامل در رد حاد پیوند کلیه تست Binary logistic regression انجام شد. پس از بررسی رابطه بین رد حاد و جنسیت دریافت کننده و همچنین اهدا کننده پیوند رابطه آماری معناداری میان آنها مشاهده نشد (جدول 4-1).

جدول 4-1: رابطه جنسیت و رد حاد پیوند
جنسیتفاقد رد حاددارای رد حادORCI(95%)P-valeuدریافت کنندهزن79181مرد1372889/072/1-46/0744/0اهدا کنندهزن74151مرد1392903/104/2-52/0934/0
در آنالیز رابطه گروههای خونی ABO و رد حاد پیوند کلیه نیز ارتباط معناداری یافت نشد. بررسی رابطه میان Rh و رد حاد به دلیل اینکه تنها 23 نفر از 262 بیمار دریافتکننده آلوگرافت دارای Rh منفی بودند، توسط تست Pearson chi-squaer صورت گرفت (جدول 4-2).

جدول 4-2: رابطه گروه خونی، RH و رد حاد پیوند
فاقد رد حاددارای رد حادORCI(95%)P-valeuگروه خونی ABOO85181A591412/143/2-52/0773/0B561193/011/2-41/0858/0AB16388/036/3-23/0858/0Rh+19643-203551/0

از نظر منبع بافتی به علت کم بودن پیوند از فرد زنده (4n=)، گیرندگان از جسد به صورت جداگانه در ادامه مورد بررسی قرار گرفتند (جداول 4-8 و 4-13 ).
هر دو گروه اهداکننده و دریافتکننده پیوند از نظر رابطه رد حاد و ریسک فاکتورکمی سن توسط آزمون آماری Independent Samples t-test مورد سنجش قرار گرفتند. در این بررسی نیز رابطه معناداری دیده نشد (جدول 4-3).

جدول 4-3: ارتباط سن در رد پیوند کلیه
میانگین سنیفاقد رد حاددارای رد حادtdfP-valueدریافت کننده پیوند9/13 ±1/425/15±3/4351/0260612/0اهدا کننده پیوند5/17±4/367/17±8/3916/1259245/0

4-3- بررسی چند شکلی ژن GPX1 pro198leu درافراد سالم و بیماران
فراوانی ژنوتیپهای CC، CT و TT و آللهای C و T از چند شکلی GPX1pro198leu در جدول 4-4 آمده است. تعادل هاردی-واینبرگ در جمعیت سالم مورد بررسی قرار گرفت که نتیجه آن در تعادل بودن جمعیت است (P>0.05، df=1، χ2=3.04).

جدول 4-4: فراوانی ژنوتیپی و آللی چند شکلی ژن GPX1 pro198leu درافراد سالم و بیمار
فراوانی در افراد سالمفراوانی در افراد بیمارتعداددرصدتعداددرصدژنوتیپCC15478/5814220/54CT10017/3810470/39TT805/31610/6آللC40886/7738805/74T11614/2213695/25
با استفاده از تست رگرسیون لجستیک آنالیز فراوانی ژنوتیپی و آللی بین دو گروه شاهد و بیمار انجام شد (جدول 4-5).

جدول 4-5: آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژن GPX1
بین گروه سالم و بیماران پیوند کلیه
سالمبیمارORCI 95%P-valueژنوتیپCC1541421CT10010413/161/1-79/0509/0TT81617/222/5-90/0084/0CT+TT vs. CC10812020/170/1- 85/0291/0آللC4083881T11613623/164/1-93/0149/0

با توجه به نتایج به دست آمده در جدول بالا ارتباط معناداری بین فراوانی ژنوتیپی و آللی چند شکلی ژن GPX1 در موقعیت کدون 198 بین جمعیت سالم و بیمار دیده نمیشود. به عبارت دیگر چند شکلی pro198leu از ژن GPX1



قیمت: تومان

دسته بندی : مقاله و پایان نامه

دیدگاهتان را بنویسید