دانشکدهی علوم

پایان نامهی کارشناسی ارشد در رشتهی
زیست شناسی- سلولی و مولکولی

بررسی ارتباط چندشکلیهای ژنتیکی ژنهای GSTM1 ، GSTT1 و CAT با خطر اعتیاد به مواد مخدر

به کوشش
محمدرشید خلیقینسب

استاد راهنما
دکتر مصطفی سعادت

شهریور 1393

به نام خدا
اظهارنامه
اینجانب محمدرشید خلیقینسب دانشجوی رشتهی زیست شناسی گرایش سلولی و مولکولی دانشکده علوم اظهار میکنم که این پایان نامه حاصل پژوهش خودم بوده و در جاهائی که از منابع دیگران استفاده کردهام، نشانی دقیق و مشخصات کامل آن را نوشتهام. همچنین اظهار میکنم که تحقیق و موضوع پایان نامهام تکراری نمیباشد و تعهد مینمایم که بدون مجوز دانشگاه دستاوردهای آنرا منتشر ننموده و یا دراختیار غیر قرار ندهم. کلیه حقوق این اثر مطابق با آییننامه مالکیت فکری و معنوی متعلق به دانشگاه شیراز است.
نام و نام خانوادگی: محمدرشید خلیقینسب
تاریخ و امضاء:
تقدیم به
پدر و مادر بزرگوارم
که دست های نوازشگرشان التیام بخش اشک های دوران طفولیتم بوده
و
تمامی فرهیختگان عرصهی دانش که الفبای زندگی را بر کشتی تندرو خیالم حک نمودند.
سپاسگزاری
به نام پادشاه پادشاهان گناه آمرز مشتی عذرخواهان
تقدیر تشکر می نمایم از تمامی دانش پژوهان، اندیشمندان و فرهیختگان عرصه پرتلاطم علم و ادب که در وجود منورشان شمشیر قلم با حریر کتاب آشتی نموده است و در حنجره شان فریاد نوع دوستی با مناجات مانوس گشته. به خصوص نهایت سپاس را دارم از استاد راهنما و مشاور اندیشمند و فرهیختهی خود جناب آقای دکتر مصطفی سعادت و دکتر ایرج سعادت که با تلاش بیدریغشان در خزان همواره تلاش نمودند تا راه راه بهار دانش را بر شاگرد حقیرشان فراهم نمایند. همچنین تشکر می کنم از جناب آقای دکتر رضا یوسفی که زحمت داوری این پایان نامه را تقبل نمودند.
چکیده
بررسی ارتباط چندشکلی های ژنتیکی ژنهای
GSTM1 ، GSTT1 و CAT با خطر اعتیاد به مواد مخدر

به کوشش
محمدرشید خلیقینسب

خانواده ژنی گلوتاتیون S ترانسفراز و کاتالاز از آنزیمهای متابولیکی مهم در سم زدایی گونههای فعال اکسیژن میباشند. هدف از این مطالعه، بررسی ارتباط چندشکلیهای ژنتیکی GSTM1، GSTT1 و CAT C-262T با استعداد ابتلاء به مواد مخدر هروئین، شیره، تریاک و شیشه میباشد. در این مطالعه مورد- شاهدی 708 نفر معتاد به مواد مخدر و 799 نفر سالم به عنوان گروه کنترل انتخاب شدند. برای تعیین ژنوتیپهای نول GSTM1 و GSTT1 از روش multiplex-PCR و تعیین ژنوتیپهای چندشکلی CAT C-262T از روش PCR- RFLP استفاده گردید. نتایج نشان داد که فراوانی ژنوتیپ های نول GSTM1 و GSTT1 در افراد معتاد به هروئین، شیره و شیشه نسبت به افراد سالم اختلاف معنی داری ندارد. همچنین حذف همزمان هر دو ژن در افراد معتاد به هروئین، شیره و شیشه در مقایسه با گروه شاهد اختلاف معنی داری را نشان نداد. فراوانی ژنوتیپ نول GSTT1 در گروه معتادان به تریاک در مقایسه با افراد سالم به طور معنی داری بیشتر بود (037/0P=، 39/2-02/1CI= 95%، 56/1OR=)، ولی ارتباط معناداری بین ژنوتیپ نول GSTM1 و خطر اعتیاد به تریاک مشاهده نگردید (052/0P=، 00/1-48/0CI= 95%، 69/0OR=). در بررسی ارتباط بین چندشکلی ژنتیکی CAT (C-262T) و خطر اعتیاد به هروئین، شیره، تریاک و شیشه، اختلاف معنی داری بین ژنوتیپهای این چندشکلی و اعتیاد به هروئین، شیره و شیشه مشاهده نشد ولی نتایج نشان داد که فراوانی ژنوتیپ TT از این چندشکلی در افراد معتاد به تریاک به طور معنی داری نسبت به افراد سالم بیشتر است (002/0P=، 40/6-49/1CI= 95%، 09/3OR=).
کلید واژه: اعتیاد به مواد مخدر- پلی مورفیسم GSTM1- GSTT1- CAT –

فهرست مطالب

عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه
1-1- اعتیاد 2
1-2- گیرندههای اپیوئیدی 4
1-3- متآمفتامین 6
1-4- علل گرایش به مواد مخدر6
1-5- کانون های پاداش و لذت در مغز6
1-6-ROS و کانال های L-Type کلسیمی7
1-7- ROS و آنزیم های آنتی اکسیدان8
1-8- گلوتاتیون S ترانسفراز8
1-9- ژن GSTM113
1-10- ژن GSTT1 14
1-11- ژنCAT 15
1-12- هدف 17
فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده
2-1- مطالعات صورت گرفته بر روی چند شکلی های ژنتیکی GSTM119
2-2- مطالعات صورت گرفته بر روی چند شکلی های ژنتیکی GSTT120
2-3- مطالعات صورت گرفته بر روی چند شکلی های تک نوکلئوتیدی CAT21
2-4- فرضیه23
عنوان صفحه
فصل سوم: روش انجام کار
3-1- نمونه گیری 25
3-2- دستگاه های مورد استفاده در پژوهش 25
3-3- استخراج DNA26
3-4- مواد مورد استفاده برای انجام PCR26
3-5- واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) 27
3-6- تعیین ژنوتیپ28
3-6-1- تعیین ژنوتیپ ژن های GSTM1، GSTT128
3-6-2-تعیین ژنوتیپ ژن CAT29
3-7- الکتروفورز 31
3-7-1- مواد مورد استفاده جهت انجام الکتروفورز31
3-7-2- تهیه ی محلولهای مورد استفاده جهت انجام الکتروفورز31
3-7-3- الکتروفورز ژن های GSTM1، GSTT1 و رنگ آمیزی ژل32
3-7-4- الکتروفورز PCR-RFLP برای ژن کاتالاز و رنگ آمیزی ژل33
3-8- تحلیل آماری 34
فصل چهارم: نتایج
4-1- مشخصات افراد شرکت کننده در پژوهش 36
4-2- مقایسه چندشکلیهای ژنتیکی GSTM1 ،GSTT1 و CAT در دو گروه معتاد به هروئین و سالم36
4-3- مقایسه چندشکلیهای ژنتیکی GSTM1 ،GSTT1 و CAT در دو گروه معتاد به شیره و سالم39
عنوان صفحه
4-4- مقایسه چندشکلیهای ژنتیکی GSTM1 ،GSTT1 و CAT در دو گروه معتاد به تریاک و سالم43
4-5- مقایسه چندشکلیهای ژنتیکی GSTM1 ،GSTT1 و CAT در دو گروه معتاد به شیشه و سالم45
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1- بحث و بررسی نتایج در ژنهای GSTM1 و GSTT1 و CAT 49
5-2- پیشنهادات 52
فهرست منابع53
فهرست جدول ها
عنوان صفحه
جدول 1-1- GSTها سیتوزولی پستانداران 11
جدول 1-2- سوبستراهای مناسب آنزیم گلوتاتیون S ترانسفراز انسانی13
جدول 3-1- مواد مورداستفاده برای تهیه واکنش میکس multiplex-PCR27
جدول 3-2- مواد مورداستفاده برای تهیه واکنش میکس ژنCAT28
جدول 3-3- برنامه mulitiplex-PCR برای تکثیر ژن های GSTM1، GSTT1 29
جدول 3-4- برنامه ی PCR برای تکثیر ژن CAT30
جدول 4-1- اطلاعات جمعیت مورد مطالعه در دو گروه معتاد به هروئین و سالم37
جدول 4-2- توزیع فراوانی ژنوتیپ‌ ژن‌های GSTT1 و GSTM1 در افراد معتاد به هروئین و سالم38
جدول 4-3- فراوانی آللی و ژنوتیپی ژن کاتالاز در افراد معتاد به هروئین و سالم38
جدول 4-4- فراوانی ژنوتیپ ها و الل های چندشکلی CAT-262 در افراد معتاد به هروئین و سالم39
جدول 4-5- اطلاعات جمعیت مورد مطالعه در دو گروه معتاد به شیره و سالم40
جدول 4-6- توزیع فراوانی ژنوتیپ‌ ژن‌های GSTT1 و GSTM1 در افراد معتاد به شیره و سالم41
جدول 4-7- فراوانی آللی و ژنوتیپی ژن کاتالاز در افراد معتاد به شیره و سالم41
جدول 4-8- فراوانی ژنوتیپ ها و الل های چندشکلی CAT-262 در افراد معتاد به شیره و سالم42
عنوان صفحه
جدول 4-9- اطلاعات جمعیت مورد مطالعه در دو گروه معتاد به تریاک و سالم43
جدول 4-10- توزیع فراوانی ژنوتیپ‌ ژن‌های GSTT1 و GSTM1 در افراد معتاد به تریاک و سالم44
جدول 4-11- فراوانی آللی و ژنوتیپی ژن کاتالاز در افراد معتاد به تریاک و سالم44
جدول 4-12- فراوانی ژنوتیپ ها و الل های چندشکلی CAT-262 در افراد معتاد به تریاک و سالم45
جدول 4-13- اطلاعات جمعیت مورد مطالعه در دو گروه معتاد به شیشه و سالم45
جدول 4-14- توزیع فراوانی ژنوتیپ‌ ژن‌های GSTT1 و GSTM1 در افراد معتاد به شیشه و سالم46
جدول 4-15- بررسی تعادل هاردی- واینبرگ در جمعیت معتاد به شیشه و سالم برای ژن کاتالاز47
جدول 4-16- فراوانی ژنوتیپ ها و الل های چندشکلی CAT-262 در افراد معتاد به شیشه و سالم47
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل 1-1- فراوانی مصرف کننده گان الکل و مواد مخدر در 6 کشور مختلف3
شکل 1-2- ساختار گیرندههای اپیوئیدی5
شکل 1-3- ROS و کانالهای L-Type کلسیمی7
شکل 1-4- آنزیم های GST مسؤل کاتالیز کردن ترکیبات کارسینوژنیک و سایتوتوکسیک از طریق کنژوگه کردن آنها با گلوتاتیون می باشند11
شکل 1-5- خانواده ی سوپر ژن گلوتاتیون-S- ترانسفراز12
شکل 1-6- شکل شماتیک ژن کاتالاز و جایگاه چندشکلی ژنتیکی مورد بررسی16
شکل 3-1- یک نمونه از آنالیز multiplex-PCR و چند شکلی ژنتیکی دو ژن GSTM1 و GSTT1 بر روی ژل آگاروز 33
شکل 3-2- تعیین ژنوتیپ چندشکلی ژن کاتالاز بر روی ژل آگاروز34

فصل اول

مقدمه
1-1: اعتیاد1

مصرف مواد مخدر یکی از خطرناک‌ترین پدیدههای جوامع بشری در عصرِ حاضر است. اعتیاد در جهان ما چنان گسترش یافته است که به یک بیماری مزمن اجتماعی تبدیل شده و امنیت اجتماعی را متزلزل ساخته است. بر طبق داده های رسمی 2/1 تا 2 میلیون ایرانی با میانگین سنی 18سال معتاد به آمفتامین هستند. بیش از 11 میلیون از جمعیت کشور با مسئلهی اعتیاد روبرو هستند. در طول 30 سالِ گذشته، جمعیت ایران با نرخ رشد سالانهی 8 درصدی، با بیماری خانمان سوز اعتیاد دست و پنجه نرم کردهاند. این آمار بیانگر این است که تعداد نوجوانانی که گرایش به مواد مخدر پیدا کرده اند؛ در حال افزایش بوده است(Afkari et al., 2013). متأسفانه امروزه گسترش و شیوع اعتیاد بهحدی است که معضلات اجتماعی، جسمانی و خانوادگی بسیاری را موجب شده است .(Agha et al., 2008)
به طوریکه سازمان جهانی سلامت برآورد کرده بود که بیش از 2 میلیارد مصرف کنندهی الکلی، 3/1 میلیارد مصرف کنندهی تنباکو و 185 میلیون مصرف کنندهی داروهای غیرِمجاز وجود داشته است. بنابراین جهتِ پرده برداشتن از سطح معضلاتی که پارهای از کشورها با آنها درگیر بودهاند نمودار ترسیمی شکل 1-1 را که بیانگر مصرف مواد مخدر و مقدار الکل مصرف شدهی این گونه کشورها میباشد به عینه دربرابر دیدگان حقیقت بین خوانندگان قرار میدهیم .(Goldman et al., 2006)

شکل 1-1- فراوانی مصرف کنندهگان الکل و مواد مخدر در 6 کشور مختلف

عواملی که در شیوع اعتیاد نقش دارند عبارتند از:
• محیط: محیط از 3 طریق میتواند در گرایش به سوء مصرف مواد مخدر نقش داشته باشد که عبارتند از:
• تجربههای جدید زندگی
• فردی که حتی برای مدت طولانی از مصرف مواد دور بوده است، در محیط پاک یا اصطلاحاً خنثی قرار داشته است؛ میتواند با قرار گرفتن در معرض محیطهای آلوده به مصرف مواد مخدر دوباره به سمت اعتیاد گرایش پیدا کند.
• تجربهی خوب مصرف مواد و تاثیرات روحی و روانی آن میتواند باعث جذب دوبارهی افراد به استفاده از اینگونه مواد مخدر شود .(Caprioli et al., 2007)
• مصرف دارو2: مصرف سوء داروهایی مثل الکل و نیکوتین، منجر به تغییر در بیان ژن ها و تغییرات رفتاری افراد درگیر با این گونه مواد شدهاند.(Sinha et al., 2009)
• ژنتیک: مطالعه بر روی خانواده و دوقلوها نقش ژنتیک در اعتیاد را تایید کرده است.
مطالعاتی که بر روی خانوادهها و دوقلوها صورت گرفته است نشان میدهد، که وابستگی به الکل، نیکوتین، حشیش و دیگر مواد مخدر غیرقانونی، تحت تاثیر فاکتور های ژنتیکی بوده است .(Agrawal et al., 2008)
البته در ارتباط با تأثير عوامل ژنتیکی در مطالعه ای که توسط Tsuang و همکاران بر روی 3372 دوقلو در ویتنام انجام گرفت؛ تأثيرات مختلفی از عوامل ژنتیکی، محیط خانوادگی و غیر خانوادگی بر روی داروهای متعدد گزارش شد که بزرگترین میزان تاثیر سوء در مصرف مواد مخدر را عوامل ژنتیکی داشتهاند .(Tsuang et al., 1998)

1-2: گیرندههای اپیوئیدی
اپیاتها3از تریاک گرفته میشوند، که تواناییِ اتصال به گیرندههای اٌپیوئیدیِ درونزا را دارند. از این گیرندهها کاپا، دلتا و میو را میتوان نام برد؛ که از خانوادهی G پروتئینها میباشند. با فعال شدن این گیرنده ها توسط اپیات‌های مانند مورفین 1- کانالهای کلسیمی حساس به ولتاژ4 بسته میشوند 2- با تأثير بر روی کانالهای پتاسیمی باعث خارج شدن پتاسیم از سلول و هایپرپلاریزه شدن سلول میشود 3- باعث مهار آنزیم آدنیلات سیکلاز میشود. درنتیجه اپیاتها باعثِ کاهشِ تحریک پذیریِ غشا و کاهش آزاد شدنِ نورترانسمیترها میشوند. در شکل 1-2 ساختار این گیرنده و مکانیسم عمل آن نشان داده شده است .(Lambert et al., 2005)از طریق این مکانیسم اپیات های مانند مورفین باعث مهار درد می شوند. رسپتورهای اپیوئیدی مختلفی در سلولهای گوناگون تولید میشوند و در موقع تحریکپذیری باعث ایجاد تاثیرات متفاوتی می‌شوند.

شکل 1-2- ساختار گیرنده های اپیوئیدی و مکانیسم عمل این گیرنده

مواد مخدر(اپیاتها) حداقل از طریق دو مکانیسم باعث تولید پاداش و تقویت آن میشوند که عبارتند از:
1. فعالسازی ناحیه تگمنتوم شکمی5 (VTA) که نتیجهاش آزاد شدن دوپامین در هستهی آکومبنس6 است.
2. به طور مستقیم به رسپتورهای هستهی آکومبنس متصل میشوند که غیر وابسته به دوپامین میباشد.
مواد مخدری که به صورت غیر وابسته به دوپامین باعث ایجاد پاداش و تقویت آن میشوند به طور مستقیم به رسپتورهای میو و شاید دلتا هستهی آکومبنس متصل میشوند. رسپتورهای میو و دلتا هم در ناحیه تگمنتوم شکمی و هم در هستهی آکومبنس وجود دارند. و ممکن است که هر دویِ آنها در مسیرِ پاداش نقش داشته باشند. اپیوئیدهای مشتق شده از پروداینورفین باعث مهار دوپامین از نورونهای مزولیمبیک میشوند و در نتیجه با فعالسازی این گیرنده ممکن است که باعث ایجاد احساس ناخوشی در انسان و حیوانات شوند. (Kopnisky et al., Chapter 96).

1-3: متآمفتامین(شیشه)
مواد مخدری مثل شیشه با تأثیر بر روی نورونهای دوپامینرژیک باعث آزاد شدن دوپامین
می شوند. اتواکسیداسیون دوپامین باعث تولید DA- quinone می شود. DA- quinone یک محصول سمی است که موجب تخریب میتوکندری، التهاب، ROS و یوبی کوتینه کردن پروتئین می شود .( Miyazakiy et al., 2008) گلوتاتیون و گلوتاتیون S ترانسفراز ممکن است باعث سم زادیی DA- quinone شوند .( Hashimoto et al., 2005)
1-4: علل گرایش به مواد مخدر
تحریکِ آزادسازیِ دوپامین توسط مواد مخدر ممکن است به شکل یک مسیر در ایجادِ لذت در مغز نقش داشته باشد. در واقع نشانگر پیامی است که فرد را به سوی مواد مخدر جذب میکند .(Tang et al., 2009)
1-5: کانونهای پاداش و لذت در مغز
ارائه پاداش و احساسِ لذت در مغز از طریق تحریک نواحیای از مغز منجمله ناحیهی تگمنتوم شکمی، هسته آکومبنس، هیپوتالاموس، آمیگدال، هیپوکامپ و قسمتهایی از کورتکس پیشانی میسر است. در مورد سیستم پاداش و لذت کانون اصلی از ناحیهی تگمنتوم شکمی آغاز میشود و به هستهی آکومبنس ختم میشود.(Hyman et al., 2006)

1-6: ROS و کانالهای L-Type کلسیمی
ROS تولید شده در طی استرسهای اکسیداتیو با تاثیر بر روی کانالهای کلسیمی
(L-Type) باعث افزایش کلسیم سیتوپلاسمی میشوند. این کانالها غنی از اسیدآمینههای سیستئین می باشند، ROS ایجاد شده باعث اکسید کردن اسیدآمینههای سیستئین و تشکیل پیوندهای دیسولفید و تغییر شکل دادن این کانالها باعث باز شدن کانالهای کلسیمی و افزایش کلسیم سیتوپلاسمی میشوند. کلسیم سیتوپلاسمی وارد میتوکندری میشود و باعث ایجاد یک پاسخ ایمنی و ایجاد ROS بیشتر می شوند.(Hool et al., 2007)

شکل1-3- تاثیر ROS بر روی کانالهای کلسیمی و باز شدن کانالها

1-7: منشا ROS و آنزیمهای آنتیاکسیدان
در طی استرس‌های اکسیداتیو گونههای فعال اکسیژن تولید می‌شوند. گونههای فعال اکسیژن به عنوان یک سم در نظر گرفته شدهاند. بنابراین گونههای فعال اکسیژن برای موجوداتی که در محیط هوازی زندگی میکنند مضر هستند. سوپراکسید آنیون و هیدروکسیل رادیکال به شدت ناپایدار و دارای نیمه عمرکوتاه هستند، در حالی که پراکسیدهیدروژن به صورت آزادانه منتشر میشود و دارای نیمه عمر طولانی است.گونههای فعالِاکسیژن بهوسیلهی چندین سیستم آنزیمی متفاوت به صورت آندوژنز یا اگزوژنز از محیط تولید میشوند. پس منشأ آندوژنز شامل میتوکندری، پراکسیزوم، لیپواکسیژنز، سیتوکروم 450P وسایتوکاینهای التهابی میباشد. منشأ اگزوژن شامل اشعهی UV، اشعههای یونیزهکننده، داروهای شیمیدرمانی و سمهای محیطی میباشد.(Terada et al., 2005)
برای غیرفعال کردن این ROS ها، سلولها آنزیمهای آنتیاکسیدان مانند کاتالاز که یکی از مهمترین آنزیمهای آنتیاکسیدان درونزا را میسازند که باعث تبدیل پراکسیدهیدروژن به آب و اکسیژن می شود .(Ghaly et al., 2012) گلوتاتیون S ترانسفراز خانوادهای از آنزیمهای چندکاره هستند که در فاز II متابولیسم باعث سمزدایی ترکیباتِ کارسینوژن، دیگر ترکیباتِ الکتروفیلیک و ROS میشوند .(Pemble et al., 1994)

1-8: گلوتاتیون Sترانسفرازها (GSTs)7
گلوتاتیون S ترانسفراز خانوادهای از آنزیمهای سمزدایی در فاز دوم متابولیسم هستند، که مسئول حفاظت از ماکرومولکولهای سلولی و کاتالیز کردنِ ترکیباتِ کارسینوژنیک ازطریق کنژوگه کردن آنها با گلوتاتیون میباشد. در شکل 1-1 طریقهی کنژوگه کردن ترکیبات زنوبیوتیک به گلوتاتیون توسط آنزیمهای گلوتاتیون S ترانسفرازها نشان داده شده استTownsend et al., 2003) ).GSTs در باکتریها، گیاهان و جانوران وجود دارند و حدود یک درصد از کل پروتئین‌های سلولی در یوکاریوتها و بعضی از پروکاریوتها را تشکیل
میدهند .(Ren et al., 2009) در انسان بیشترین سطح فعالیت GSTs در کبد است در حالی که کلیه، شش و روده سطح فعالیت کمتری نسبت به کبد دارند .(Pacifici et al., 1988) GSTs در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی مانند کاهش آسیب رادیکالهای آزاد، سم زدایی، بیوسنتز و متابولیسم پروستاگلاندینها، استروئیدها، لوکوترینها و تنظیم سیگنال سلولی نقش دارند .(Laborde et al., 2010)
گلوتاتیونS ترانسفراز انسانی به سه خانوادهی سیتوزولی8، میتوکندریایی9 و میکروزومی10 تقسیم میشوند. گلوتاتیون S میکروزومی ساختارهای مجزا از گلوتاتیون S ترانسفرازهای سیتوزولی میباشند ولی دارای عملکرد مشابه در توانای کنژوگه کردنGSH به ترکیبات الکتروفیلیک هستند (McIlwain et al., 2006).

گلوتاتیون S ترانسفراز های انسانی: GSTs انسانی عبارتند از: alpha روی کروموزوم 6p12، mu روی کروموزوم1p13 ، theta روی کروموزوم 22q11، pi روی کروموزوم 11q13، zeta روی کروموزوم14q24، sigma روی کروموزوم 4، kappa روی کروموزوم 7q34 وmgst1 روی کروموزوم 12p12، تعداد زیرواحد و ژن در شکل 1-2 نشان داده شده است .(Strange et al., 2001)

GSTs سیتوزولی: GSTs سیتوزولی دارای زیرواحدهای 29-24 کیلودالتونی هستند و میتوانند باعث تشکیل هومودایمر یا هترودایمر شوند فرم فعالِ آنزیم به صورت دایمر میباشد و هر آنزیم فعال دارای دو سایت است که عبارتند از G-site و H-site. G-site به GSH و H-site به ترکیبات هیدروفوب متصل میشود. GSTs سیتوزولی را بر اساس همولوژی توالی، نقطهی ایزوالکتریک، انتخاب سوبسترا و کنتیک آنزیمی تقسیم بندی میکنند .(Van der Aar et al., 1996)
GSTs سیتوزولی شاملِ گلوتاتیون S ترانسفراز Alpha،Mu ،Omega ، Pi، Sigma، Theta و Zeta هستند، در جدول 1-1 گلوتاتیون S ترانسفراز سیتوزولی پستانداران نشان داده شده است .(Laborde., 2010)در جدول 1-2 حالتهای همودایمر GSTs و سوبستراهای مشخص شده برای هریک از GSTs های سیتوزولی انسانی نشان داده شده است. ایزوآنزیمهای GSTs سیتوزولی در انسان درداخل یک کلاس بیش از 40 درصد، و با کلاس های دیگر، کمتر از 25 درصد دارای همانندی هستند .(Terada., 2005)تمرکز عمده بیشتر بر روی دومین حفظ شدهیN ترمینال گلوتاتیون S ترانسفراز سیتوزولی است که دارای اسیدآمینههای کاتالیتیکی فعال تیروزین، سیستئن یا سرین می باشد .(McIlwain et al., 2006)

جدول1-1- GSTs سیتوزولی پستانداران
شکل 1-4- آنزیم های GST مسئول کاتالیز کردن ترکیبات کارسینوژنیک و سایتوتوکسیک
از طریق کنژوگه کردن آنها با گلوتاتیون میباشند

شکل 1-5- خانوادهی سوپر ژن گلوتاتیون s ترانسفراز

جدول 1-2- سوبستراهای مناسب آنزیم گلوتاتیون – s – ترانسفراز انسانی

1-9: ژن GSTM1
این آنزیم به دلیل ارتباطش با سرطان مثانه و دیگر سرطانهای که که با عادت به سیگار کشیدن دارای ارتباط باشند و به دلیل نقش آن در سمزدایی بنزوآلفا پیرن11 و دیگر هیدروکربن های آروماتیک چند حلقهای موجود در دود تنباکو مورد توجه قرار گرفته است.(Engel et al., 2002)
ژن های کلاس Mu، به صورت یک خوشهی ژنی متشکل از ژنهای GSTM1، GSTM2، GSTM3، GSTM4 و GSTM5 که برروی کروموزوم 1p13.3 واقع شدهاند. ترتیب قرار گرفتن آنها بر روی کروموزوم به صورت GSTM4-GSTM2-GSTM1-GSTM5-GSTM3-3′ 5′- است Pearson et al., 1993) .(Strange et al., 2001, ژن GSTM1 پلی مورف است. چندشکلیهای که از ژن GSTM1 شناسایی شده است: یکی از این چند شکلی ها به صورت GSTM1 null و دیگر به صورت GSTM1 A و GSTM1 B هستند. GSTM1 null هیچ محصول پروئتینی را کد نمیکند. ژنهای GSTM1Aو GSTM1B کدکنندهی پروتئینهای GSTM1 A وGSTM1 B هستند، که دارای عملکرد یکسان و تفاوت این دو فقط در یک اسیدآمینه است . پروتئین GSTM1 A دارای اسیدآمینهی لایزین در موقعیت 172 هست در حالی که پروتئین GSTM1 Bدارای اسیدآمینه ی آسپارژین در همین موقعیت است. محصول این دو تا ژن باهم ترکیب و باعث تولید آنزیم های فعال همو یا هترودایمر میشود .(Hatagima et al., 2000)
برخی از افرادِ فاقد ژن GSTM1 و برخی دارای GSTM1 میباشند. ژنوتیپ GSTM1 null هیچ محصول پروتئینی را کد نمیکند. فردِ دارای ژنوتیپ (GSTM1- null) از تمام فعالیت هایی که توسط پروتئين GSTM1 صورت میگیرد مانند سمزداییِ12 مواد سرطان زا، سم زدایی هیدروکربنهای آروماتیک چندحلقه ای و دیگر متابولیتهای فعالِ مربوط به این آنزیم محروم میباشد. افرادِ دارای ژنوتیپ present GSTM1که کدکنندهی پروتئین GSTM1 است و باعث سمزدای در فاز دوم متابولیسم میشوند .(Sharma et al., 2012)

1-10: ژن GSTT1
ژنهای کلاس theta در انسان عبارتند از: GSTT1 و GSTT2. ژن GSTT1 و GSTT2 بر روی کروموزوم 22q11.2 انسانی قرار دارند .(Webb et al. 1996) که بهوسیله ی یک قطعهی kb50 از همدیگر جدا شدهاند، آنها دارای ساختار مشابه هستند که از 5 اگزون با توالی یکسان intron/exon تشکیل شده اند.(Strange et al., 2001)
ژن GSTT1 پلیمورف است. GSTT1 دارای دو تا ژنوتیپ GSTT1 null و GSTT1 present میباشند .(Shaikh et al., 2010) ژنوتیپ GSTT1 null هیچ محصول پروتئینی را کد نمیکند در نتیجه افرادای دارای ژنوتیپ GSTT1 null فاقد فعالیت آنزیمی هستند. افراد دارای GSTT1 present باعث تولید آنزیم فعال میشود؛ که میتواند باعث سم زدایی گونههای فعال اکسیژن و مواد سرطانزا شود .(Tamer et al., 2004)و فراوانی الل نول این ژن در جمعیتهای مختلف انسانی 60-20 درصد است .(Vellingiri et al., 2014)

1-11: کاتالاز13
آنزیم کاتالاز در ابتدا در سال 1818مورد توجه لویس تنارد قرار گرفت وقتیکه آب اکسیژنه را کشف کرد. فرضیهی او این بود که پراکسیدهیدروژن به وسیلهی یک ماده ناشناخته باعث آزادسازی اکسیژن میشود .(Calabrese et al., 1989) درسال 1900اسکارلوو برای اولین بار نام کاتالاز را برای این ماده انتخاب کرد که در بسیاری از گیاهان و جانوران وجود دارد (Loew et al., 1900) کاتالاز وزن مولکولی در حدود 240000 دالتون دارد، از چهار زیرواحد یکسان تشکیل شده است، هر زیرواحد دارای یک حلقهی پرتوپورفیرین و یک اتم آهن در مرکزش است. آنزیم کاتالاز یکی از آنزیمهای مهم آنتیاکسیدان داخلی میباشد. سمومی مانند پراکسید هیدروژن را به آب و اکسیژن تبدیل میکند. کاتالاز در پراکسی زوم وجود دارد و باعث تجزیهی پراکسید هیدروژن میشود. در پستانداران بیشترین سطح کاتالاز در کبد، کلیه، گلبولهای قرمز و کمترین سطح کاتالاز، در بافتهای همبند وجود دارد (Quan et al., 1986).
پراکسید هیدروژن در غلظتهای بالا میتواند برای سلول سمی باشد و موجب بعضی از فرایندهای فیزیولوژیکی مانند تقسیم سلولی، آپوپتوز و فعال شدن پلاکتها در غلظت کم شود (Labios et al., 2009).
کاتالاز در دو مرحله باعث تجزیهی پراکسید هیدروژن و تبدیل آن به آب و اکسیژن میشود. که مکانیسم کلی آن به صورت زیر می باشد .(Aksoy et al., 2004)

آهن در مرکز حلقه‌ی هم وجود دارد. پراکسید هیدروژن وارد سایت فعال آنزیم میشود و با اسیدآمینههای Asn147 و His74 برهمکنش، میدهد. این برهمکنش، باعث میشود که اتم هیدروژن بین اتم های اکسیژن منتقل شود و ایجاد یک مولکول آب و تشکیل کمپلکس I شود (کمپلکسI حاوی آهن IVمیباشد. Fe(IV) O=) در این حالت هِم14 در حالت رادیکال وجود دارد و با پراکسیدهیدروژن دوم وارد واکنش میشود و موجب ایجاد یک مولکول آب و اکسیژن میشود همچنین آنزیم کاتالاز، به حالت پایه که حاوی آهن Fe(III) است برمیگردد (Reid et al., 1981, Goyal et al., 2010)

ژن کاتالاز: در انسان ژنی که باعث کدکردن آنزیم کاتالاز میشود بر روی کروموزوم شماره13p11 قرار دارد. ژن کاتالاز دارای 13 اگزون و 12 اینترون میباشد (Quan et al., 1986). یکی از پلیمورفیسمهای شایع در ژن کاتالاز پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی است که به صورت جابجای C با T که در ناحیهی پروموترِ ژن کاتالاز(–262C>T) رخ میدهد بر روی اتصال فاکتورهای پروتئینی و درنتیجه بر روی فعالیت آنزیم کاتالاز تاثیر میگذارد (Forsberg et al.,2001). در شکل1-4 ساختار ژن کاتالاز و جایگاه چندشکلی ژنتیکی مورد بررسی نشان داده شده است (Liu et al., 2010).

شکل 1-6- شکل شماتیک ژن کاتالاز و جایگاه چندشکلی ژنتیکی مورد بررسی
1-12: هدف
در طی استرسهای اکسیداتیو گونههای فعالِ اکسیژن (ROS)15تشکیل میشوند که با تغییر فعالیت کانالهای کلسیمی موجب افزایش کلسیم سیتوپلاسم میشوند .(Hool et al.2007) افرادی که ژن های فعال GSTM1 و GSTT1 ندارند یا در ناحیه پروموتور ژن کاتالاز دارای آلل T باشند، توانایی سمزدایی این گونههای فعال را ندارند، لذا احتمال اینکه کانالهای کلسیمی در طی استرس اکسیداتیو همواره باز باشد، بیشتر میباشد و احتمالا این افراد احساس درد بیشتری دارند. به همین علت رو به مصرف مواد مخدر میآورند تا تسکینی بر دردهایشان باشد. با توجه به روند رو بهرشد اعتیاد به مواد مخدر، بر آن شدیم تا در این مطالعه به بررسی ارتباط بین چندشکلیهای ژنتیکیِ ژن های GSTM ، GSTT1و CAT و اعتیاد به مواد مخدر بپردازیم.

.

فصل دوم

مروری بر تحقیقات انجام شده

ارتباط چندشکلی ژنهای GSTM1، GSTT1 و CAT با انواع سرطانها، دیابت مزمن و فراوانی این چندشکلیها در جمعیتهای مختلف موضوع مطالعه در بسیاری از مقالات بوده است. ولی با وجود این تحقیقات ارزشمند هنوز تحقیق جامعی در ارتباط بین چندشکلی ژن GSTM1، GSTT1 و CAT خطر اعتیاد به هروئين، تریاک و شیره تاکنون صورت نگرفته است؛که این پژوهش درصدد انجام آن است.
2-1: مطالعات صورتگرفته بر روی چند شکلیهای ژنتیکی GSTM1
– براساس یک مطالعه که توسطTamer و همکارانش در سال 2005 در ترکیه بر روی چندشکلی ژن GSTM1 در افراد سیگاری با سرطان معده بررسی کردهاند، ژنوتیپ نول GSTM1 ارتباط با پیشرفت سرطان معده دارد .(Tamer et al., 2005)
– براساس یک مطالعه که توسط Piacentini و همکارانش در سال 2012 در ایتالیا بر روی چندشکلی ژنتیکی GSTM1 با آسم در بیماران بزرگسال صورت گرفت هیچ ارتباط معناداری بین این پلیمورفیسم و بیماری آسم در افراد بزرگسال مشاهده نشده است .(Piacentini et al., 2012)
– براساس یک مطالعه که توسط Moasser و همکارانش در سال 2012 در شیراز(ایران) که بر روی پلی مورفیسم ژن GSTM1 با دیابت ملیتوس نوع 2 صورت گرفت، ارتباط معناداری بین ژنوتیپ نول این پلیمورفیسم با بیماری دیابت ملیتوس نوع 2 مشاهده شده است .(Moasser et al., 2012)
– براساس یک مطالعه که توسط Safarinejad و همکارانش در سال 2013 در تهران(ایران) بر روی چندشکلی ژنتیکی GSTM1 و ریسک ابتلا به سرطان مثانه در 166 مرد مبتلا به سرطان مثانه و 322 مرد سالم صورت گرفت، با مقایسه افراد بیمار و سالم در ارتباط با ژنوتیپ GSTM1 هیچ ارتباط معناداری بین این پلیمورفیسم و ریسکِ ابتلا به سرطان مثانه دیده نشده است .(Safarinejad et al., 2013)
– بر اساس یک مطالعه که توسط Sandoval-Carrillo و همکارانش در سال 2014 در مکزیک بر روی چندشکلی ژنتیکی GSTM1 و افزایش ریسک ابتلا پرهکلامپسی بر روی 112 زن مبتلا به پرهکلامپسی و 233 زن سالم صورت گرفت، با مقایسهی افراد سالم و بیمار در ارتباط با ژنوتیپ GSTM1 هیچ ارتباط معناداری بین این پلیمورفیسم و افزایش ریسک ابتلا به پرهکلامپسی وجو نداشت .(Sandoval-Carrillo et al., 2013)
– براساس یک مطالعه که توسط Nakatome و همکارانش در سال 2009 در ژاپن بر روی چند شکلی ژن GSTM1 و مصرفکنندگان متآمفتامین صورت گرفت، اختلاف معناداری بین ژنوتیپ نولِ این پلیمورفیسم و مصرف متآمفتامین در جمعیت زنهای مصرفکنندهی متآمفتامین مشاهده نمودند .(Nakatome et al., 2009)
2-2: مطالعات صورت گرفته بر روی چند شکلیهای ژنتیکی GSTT1

براساس یک مطالعه که توسط Moasser و همکارانش در سال 2012 در شیراز(ایران) که بر روی پلیمورفیسم ژن GSTT1 با دیابت ملیتوس نوع 2 صورت گرفت، هیچ ارتباط معناداری بین ژنوتیپ نول این پلیمورفیسم با بیماری دیابت ملیتوس نوع 2 مشاهده نشده است .(Moasser et al., 2012)
براساس یک مطالعه که توسط Sivonova و همکارانش در سال 2009 در اسلواکی بر روی پلیمورفیسم ژن GSTT1 با سرطان پروستات صورت گرفت، هیچ ارتباط معناداری بین این پلیمورفیسم و خطر ابتلا به سرطان پروستات مشاهده نشده است .(Sivonova et al., 2009)
براساس یک مطالعه که توسط Hashimoto و همکارانش در سال 2008 در ژاپن صورت گرفت، هیچ ارتباط معناداری بین پلیمورفیسمهای ژن آنزیمهای مرتبط با GSH، شامل GSTT2(rs1622002)، GSTA1(-69C/T)، GSTO1(rs4925)، GPX1(rs1050450)، GCLM( -588C/T) و GCLM (rs2301022) و مصرف متآمفتامین در جمعیت ژاپن نداشت. ولی فراوانی ژنوتیپ نول GSTT1 ارتباط معناداری بالای در بین مصرف کنندگان متآمفتامین نسبت به گروه کنترل داشته، و ممکن است پلیمورفیسم ژن GSTT1 یک ریسک فاکتور ژنتیکی در گسترش اعتیاد به مصرف متآمفتامین باشد (Hashimoto et al., 2008).
براساس یک مطالعه که توسط Nakatomeو همکارانش در سال 2009 در ژاپن بر روی چندشکلی ژن GSTT1 و مصرفکنندگان متآمفتامین صورت گرفت، ارتباط معناداری را بین این پلیمورفیسم و مصرف متآمفتامین در جمعیت ژاپن مشاهده کردند .(Nakatome et al., 2009)

2-3: مطالعات صورت گرفته بر روی چندشکلی تک نوکلئوتیدی در ناحیه‌یC-262T پروموتور ژن CAT16
– بر اساس یک مطالعه که توسطChistiakov و همکارانش در سال 2006 در روسیه صورت گرفت، ارتباط معناداری بین پلیمورفیسم ژن کاتالاز C-262T با بیماری دیابت نوروپاتی وجود داشت (افراد با ژنوتیپTT میزان فعالیت کاتالاز گلبولهای قرمز نسبت به افراد با ژنوتیپ CC بیشتر است .(Chistiakov et al., 2006)
-براساس یک مطالعه که توسط Choi و همکارانش در سال 2007 در آمریکا بر روی چندشکلی های ژنتیکی در ژنهای مرتبط با استرسهای اکسیداتیو و ریسک ابتلا به سرطان پروستات در افرادی که زیاد سیگار میکشند صورت گرفت، هیچ ارتباط معناداری بین پلیمورفیسم ژن کاتالاز C-262T و سرطان پروستات دیده نشده است (مردان کمتر از 65 سال با ژنوتیپ TT با افزایش ریسک ابتلا به بیماری همراه است (Choi et al ., 2007).
-براساس یک مطالعه که توسط Franko و همکارانش در سال 2008 در اسلوونی بر روی چندشکلی ژنتیکی کاتالاز C-262Tبا آزبستوزیس صورت گرفت، ممکن هست که ژنوتیپTT ارتباط کمی با ریسک ابتلا به آزبستوزیس داشته باشد (Franko et al., 2008).
– براساس یک مطالعه که توسط Galecki و همکارانش در سال2009 در لهستان بر روی چندشکلی ژنتیکی C-262T با اختلال افسردگی صورت گرفت، هیچ ارتباط معناداری بین این پلیمورفیسم و خطر ابتلا به افسردگی دیده نشده است (Galecki et al., 2009).
– براساس یک مطالعه که توسط Ezzikouri و همکارانش در سال 2010 در مراکش بر روی چندشکلی ژنتیکی کاتالاز262- با سرطان کبد در جمعیت صورت گرفت، ارتباط معناداری بین افزایش ژنوتیپTT با سرطان کبد مشاهده شده است (Ezzikouri et al., 2010).
– بر اساس یک مطالعه که توسط Ghaly و همکارانش در سال 2012 در مصر بروی چندشکلی ژنتیکی کاتالاز262- با بيماري لوپوس اريتماتوز سيستميك صورت گرفت، ارتباط معناداری بین این پلی مورفیسم با بیماری لوپوس دیده نشده است.(بیماران با ژنوتیپ TT و CT کاتالاز با فعالیت کمتری دارند (Ghaly et al., 2012).
– بر اساس یک مطالعه که توسط Babusikova و همکارانش در سال 2013 بر روی چندشکلی ژنتیکی C-262T و آسیب اکسیداتیو با بیماریِ آسم در کودکان اِسلواکی صورت گرفت، ارتباط معناداری بین افزایش ژنوتیپ TT و بیماران مبتلا به آسم دیده شد (Babusikova et al., 2013).
تاکنون مطالعه ای پیرامون چندشکلیهای CAT و احتمال ابتلا به سوء مصرف مواد مخدر صورت نپذیرفته است.

2-4: فرضیه
فرضیهی 1: ژنوتیپ نول (GSTM1- null) احتمال ابتلا به سوء مصرف مواد مخدر را افزایش می دهد.
فرضیهی 2: ژنوتیپ نول (GSTT1- null) احتمال ابتلا به سوء مصرف مواد مخدر را افزایش میدهد.
فرضیهی 3: با افزایش تعداد ژنوتیپهای نول GSTM1 و GSTT1 احتمال ابتلا به سوء مصرف مواد مخدر افزایش مییابد.
فرضیهی 4: ژنوتیپ CT در مقایسه با ژنوتیپ CC احتمال ابتلا به سوء مصرف مواد مخدر را افزایش میدهد.
فرضیهی 5: ژنوتیپ TT در مقایسه با ژنوتیپ CC احتمال ابتلا به سوء مصرف مواد مخدر را افزایش میدهد.
فرضیهی 6: با افزایش آلل T احتمال ابتلا به سوء مصرفمواد مخدر افزایش مییابد.

فصل سوم

روش انجام کار

3-1- نمونهگیری
در این مطالعه مورد – شاهد، در مجموع 1507 نفر شامل 708 معتاد به هروئين، تریاک، شیشه و شیره هستند که از 6 مرکز دولتی و غیردولتی ترک اعتیاد نمونه های خون آنها گرفته شده است 799 نفر سالم، به عنوان گروه شاهد در نظر گرفته شدند که نمونههای خون آنها از پایگاه انتقال خون شیراز فریز شده و به آزمایشگاه آورده شدند. اطلاعات مربوط به هر فرد از طریق پرسش نامهای که توسط خود فرد تکمیل می گردد به دست آمد. رضایت نامه از بیماران و از افراد سالم اخذ شده، و انجام این مطالعه توسط کمیته اخلاق دانشگاه شیراز تأیید شده است.
3-2- مواد و دستگاه ها
دستگاههای مورد استفاده در این پژوهش عبارتند از:
1. سمپلر
2. ترازو
3. Vortex
4. میکروسانتریفیوژ
5. Electrophoresis( که شامل تانک و منبع جریان برق می باشد)
6. دستگاه PCR17
7. مایکروفر
8. اتوکلاو
9. دستگاه Gel documentation
10. Rotator
11. pH-meter
12. Hot plate
3-3: استخراج DNA
روش استخراج، روش Boiling یا جوشاندن است که DNA را از گلبولهای سفید خون محیطی جدا میکند. ابتدا باید محلولهای استخراج را آماده و سپس اتوکلاو کرد و بعد از اتوکلاو در آون قرار داده میشوند، در طی چند ساعت و سپس از آنها استفاده کرد.
3-4: مواد مورد استفاده برای انجام PCR
1) پرایمرهای Forward و Reverse ژنهای GSTM1، GSTT1 و –globineβ (ساخت شرکت تکاپوزیسیت)
2) پرایمرهای Forward و Reverse ژن CAT
3) آب استریل
4) 10x buffer
5) MgCl2
6) dNTPs
7) Taq Polymerase
3-5: واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR)
برای انجام این نوع PCR باید کلیهی مواد مورد استفاده را از فریزر 20- به جز آنزیم Taq Polymerase بیرون آورد و همه را ذوب کرد و تمام مواد مورد استفاده به جز dNTPs را باید ورتکس و مواد مورد استفاده برای ساختن میکس PCR را بر روی ظرف یخ قرار میدهیم. buffer 10xو MgCl2 قبل از استفاده باید با درجه ی 7 یا 8 ورتکس شوند و پرایمرها را در حد خیلی کم باید ورتکس شوند. پس از ساختن میکس PCR آنزیم Taq Polymerase را به آن اضافه کرد. آنزیم Taq Polymerase در ته تیوب حاوی میکس ته نشین می شود از پیپت کردن جهت همگن کردن محلول میکس استفاده می شود. برای تهیه ی 25میکرولیتر محلول واکنش PCR به ازای هر تیوب مطابق جدول زیر باید عمل کرد.
جدول3-1- مواد مورداستفاده برای تهیه واکنش میکس multiplex-PCR
مواد مورد استفادهمقدار مورد استفاده (μl)آب استریل95/910x buffer5/2MgCl275/0dNTPs5/0پرایمر رفتGSTM11پرایمر برگشتGSTM11پرایمر رفتGSTT11پرایمر برگشتGSTT11پرایمر رفتβ-globine1پرایمر برگشتβ-globine1Taq polymerase3/0DNA template5
جدول3-2- مواد مورداستفاده برای تهیه واکنش میکس ژن CAT
مواد مورد استفادهمقدار مورد استفاده (μl)آب استریل95/1310x buffer5/2MgCl275/0 dNTPs5/0پرایمر رفتCAT1پرایمر برگشتCAT1 Taq polymerase3/0 DNA template5

3-6- تعیین ژنوتیپ
3-6-1- تعیین ژنوتیپ ژن های GSTM1، GSTT1
پرایمر های مورد استفاده برای واکنش multiplex PCR برای ژنهای GSTM1و GSTT1
(GSTM1) Forward: 5′-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C-3′
(GSTM1) Reverse: 5′-CTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G-3′
(GSTT1) Forward: 5′-TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC-3′
(GSTT1) Reverse: 5′-TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA-3′
(β-globine) Forward: 5′-CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC-3′
(β-globine) Reverse: 5′-GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3′

بتا گلوبین جز ژن های خانه دار18 هست که از آن به عنوان کنترل داخلی استفاده می کنند. در مرحله آخر میکس حاوی نمونهها در درون دستگاه PCR قرار میدهیم. برنامه multiplex-PCR برای این ژنها مطابق جدول زیر تنطیم گردیده است. تعداد سیکلهای تنظیم شده برای تکثیر این ژنها 30 سیکل می باشد.
جدول 3-3- برنامه mulitiplex-PCR برای تکثیر ژنهای GSTM1، GSTT1
مرحلهدما بر حسب سانتی گرادزماندناتوراسیون اولیه945دقیقهدناتورسیون941دقیقهاتصال5/6540 ثانیهطویل شدن721دقیقهبسط نهایی725دقیقه
محصول multiplex-PCR دارای یک تا سه باند است. کنترل داخلی در همه ی نمونهها دیده میشود و طول باند آن 268 جفت باز میباشد. دو باند دیگر که طول آنها 219 و 459 جفت بازی میباشد به ترتیب مربوط به ژنهای GSTM1و GSTT1 هست. ژنوتیپ ژنهای GSTM1و GSTT1 به صورت null و present در افراد مشاهد میشود در حضور کنترل داخلی بتاگلوبین پلیمورفیسم این ژنها قابل تشخیص است.
3-6-2: تعیین ژنوتیپ ژن19CAT
پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر ژن CAT :

(CAT) Forward: 5′-CTGATAACCGGGAGCCCCGCCCTGGGTTCGGATAT-3′
(CAT) Reverse: 5′-CTAGGCAGGCCAAGATTGGAAGCCCAATGG-3′
برنامهی PCR برای تکثیر ژن کاتالاز مطابق جدول زیر تنظیم گردیده است. تعداد سیکل های تنظیم شده برای تکثیر این ژن 35 سیکل میباشد.

جدول 3-4- برنامهی PCR برای تکثیر ژن CAT
مرحلهدما بر حسب سانتی گرادزمان (دقیقه)دناتوراسیون اولیه945دناتوراسیون941اتصال681طویل شدن721بسط نهایی7210
محصول PCR برای ژن کاتالاز یک قطعهی 190 جفت بازی میباشد. که پس از انجام PCR نیاز به آنزیم محدودکننده برای برش ژن کاتالاز داریم. مواد مورد استفاده برای برش ژن کاتالاز پس از PCR
➢ آب استریل
➢ آنزیم محدودکنندهی EcoRV
➢ بافر H
مقدار مورد استفاده برای انجام RFLP برای ژن CAT در هر نمونه بصورت زیر میباشد:
1. آب استریل: 5/17 میکرولیتر
2. آنزیم محدودکننده EcoRV: 5/0 میکرولیتر
3. بافر H: 2 میکرولیتر
4. محصول PCR : 10 میکرولیتر
پس از تهیهی مخلوط فوق آن را spin downکرده، و آن را به مدت30/16 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور قرار میدهیم.

3-7: الکتروفورز

3-7-1: مواد مورد استفاده جهت انجام الکتروفورز
1) آگاروز
2) TBE 5X
3) TBE 0/5X
4) 6x loading buffer
5) DNA ladder
6) اتیدیوم بروماید
3-7-2: طریقهی تهیهی محلولهای مورد استفاده جهت انجام الکتروفورز
– TBE 5X
54 گرم Tris base و 5/27 گرم Boric Acid را وزن کرده و در داخل شیشهی یک لیتری میریزیم و 20 میلی لیتر EDTAرا بر روی آن ریخته سپس مقدار کمی آب به آن اضافه میکنیم و خوب هم میزنیم و پس از هم زدن حجم آن را به 1000 میرسانیم.
– TBE 0/5X
100 میلی لیتر از TBE 5X را با 900 میلی لیتر آب تصفیه شده مخلوط کرده و پس از هم زدن خوب TBE 0/5X برای استفاده آماده است.
– محلول اتیدیوم بروماید برای رنگ آمیزی ژل
70 میکرولیتر از رنگ اتیدیوم را در 700 میلی لیتر TBE 0/5X حل میکنیم
– محلول EDTA
38/5 گرم EDTA را در 30 میلی لیتر آب تصفیه شده حل کرده و PH آن به 8 میرسانیم

3-7-3: الکتروفورز GSTM1 و GSTT1 و رنگ آمیزی ژل
پس از انجام PCR قطعات DNA حاصل را در چاهکهای ژل اگارز %5/1 load کرده (جهت درست کردن ژل آگاروز از مایکروفر استفاده می شود) و پس از اتصال جریان برق DNA چون دارای بار منفی هست به طرف قطب مثبت حرکت کرده، وقتی بر روی ژل مسافتی بیش از نصف طول ژل را طی کرد آن را در درون رنگ اتیدیوم بروماید در حدود 10 دقیقه قرار میدهیم و پس از رنگآمیزی در دستگاه Gel Documentation آن را مشاهده خواهیم کرد. اگر شخص مورد نظر برای هر دو تا ژن GSTM1 و GSTT1 نول باشد، فقط یک باند که مربوط به ژن بتا-گلوبین است دیده خواهد شد، که طول این باند 268 جفت باز میباشد. اگر شخص مورد نظر برای ژن GSTT1 نول باشد، باند مربوط به ژن بتا-گلوبین و ژن GSTM1دیده خواهند شد، که طول این باندها به ترتیب 268 و 219 جفت باز میباشند. اگر فردی هر دو تا ژن GSTM1 و GSTT1 را داشته باشد سه باند ژنی که مربوط به ژن های GSTT1، بتا-گلوبین و GSTM1 است دیده خواهند شد. که طول آنها به ترتیب 459، 268 و 219 جفت باز می باشند. در شکل 1-3 ژنوتیپ مربوط چندشکلی ژن های GSTM1 و GSTT1 نشان داده شده است.
شکل 3-1- یک نمونه از آنالیز multiplex-PCR مربوط به چندشکلی ژن های GSTM1 و GSTT1
خط1: مارکر 100 جفت بازی، خط2: present/GSTT1-present GSTM1-، خط3: null/GSTT1-present GSTM1-، خط4: null/GSTT1-null GSTM1-، خط5: present/GSTT1-null GSTM1-
3-7-4- الکتروفورز PCR-RFLP برای ژن کاتالاز و رنگآمیزی ژل
قطعات DNA حاصل ازPCR-RFLP را جهت تعیین ژنوتیپ کاتالاز بر روی چاهکهای ژل آگارز 5/1 درصد load کرده و پس از اتصال جریان برق DNA چون دارای بار منفی هست به طرف قطب مثبت حرکت کرده، وقتی بر روی ژل مسافتی بیش از نصف طول ژل را طی کرد آن را در درون رنگ اتیدیوم بروماید در حدود 10 دقیقه قرار میدهیم و پس از رنگ آمیزی در دستگاه Gel Documentation آن را مشاهده خواهیم کرد.
بر روی ژل سه نوع ژنوتیپ دیده میشود که عبارتند از: CC، CT، T
ژنوتیپ CC که ژنوتیپ وحشی ژن C-262T است توسط آنزیم EcoRV برش خورده و باعث ایجاد باندهای 157 و33 جفت بازی میشود. اگر ژن کاتالاز 262- جایگاهی برای برش آنزیم EcoRV نداشته باشد فقط یک باند 190 جفت بازی بر روی ژل مشاهده میشود که نشان دهندهی ژنوتیپ TT میباشد. و اگر یکی از رشته ها جایگاه برش داشته باشد و دیگری نداشته باشد بر روی ژل سه باند 190، 157و 33 جفت بازی مشاهده میشود که نشان دهنده‌ی ژنوتیپ CT میباشد. در شکل 3-2 ژنوتیپ این چند شکلی دیده میشود.

شکل 3-2- باندهای حاصل از تاثیر آنزیم EcoRV بر روی محصول PCR
بر روی ژل آگاروز و ایجاد ژنوتیپهای CC، CT و TT
3-8: تحلیل آماری دادهها
نتایج حاصل از این پژوهش با استفاده از نرم افزار آماری SPSS16 با در نظر گرفتن سطح معنی داری 05/0>P، و با استفاده از آزمون های کای اسکویر و رگرسیون لجستیک مورد بررسی قرار گرفتند.

فصل چهارم
نتایج
4-1: مشخصات افراد شرکتکننده در پژوهش
در این مطالعه مورد- شاهدی، در مجموع 1507 نفر که شامل 708 نفر معتاد به هروئین، تریاک، شیشه و شیره که از 6 مرکز دولتی و غیر دولتی ترک اعتیاد در شیراز(جنوب ایران) نمونهی خون آنها گرفته شده به عنوان مورد20 و 799نفر سالم به عنوان گروه شاهد21 در این پژوهش مورد بررسی قرار گرفتند که اطلاعات مربوط به هر گروه با ژنوتیپهای بررسی شده در جداول زیر ذکر شده است.
4-2: مقایسه چندشکلیهای ژنتیکی GSTM1، GSTT1 و CAT در افراد معتاد به هروئین و سالم
مشخصات افراد معتاد به هروئین22 و سالم در جدول 4-1 نشان داده شده است: در این مطالعه 442 نفر مرد و زن معتاد به هروئین با میانگین سنی 9/9±3/38 سال و 799 نفر مرد و زن سالم با میانگین سنی 7/12±5/38 سال به مورد بررسی قرار گرفتند.
جدول4-1- اطلاعات جمعیت مورد مطالعه در دو گروه معتاد به هروئین و افراد سالم
افراد سالمافراد معتاد به هروئینفاکتور مورد مطالعه799442تعداد7/12±5/389/9±3/38میانگین سنی(سال)65-1965-19محدودهی سنی(سال)جنسیت 662400مرد13742زن
مقایسه چندشکلیهای ژنتیکی GSTM1 و GSTT1 در دو گروه معتاد به هروئین و سالم در جدول 4-2 نشان داده شده است: میزان ژنوتیپ نول GSTM1 در افراد معتاد به هروئین 5/51 درصد و در افراد سالم 54 درصد است. تجزیه و تحلیل آماری نشان داد که اختلاف معناداری بین افراد معتاد به هروئین و سالم از نظر ژنوتیپ نول GSTM1 وجود نداشت. میزان ژنوتیپ نول GSTT1 در افراد معتاد به هروئین 8/24 درصد و در افراد سالم 9/20 درصد است. تجزیه و تحلیل آماری نشان داد که اختلاف معناداری بین افراد معتاد به هروئین و سالم از نظر ژنوتیپ نول GSTT1 وجود نداشت.
در جدول 4-2 ارتباط بین ترکیب ژنوتیپهای GSTM1 و GSTT1با احتمال ابتلا به سوء مصرف هروئین نشان داده شده است. فراوانی افراد معتاد به هروئین که در هیچ کدام از دو ژن GSTM1 و GSTT1 آنها حذف صورت نگرفته 2/35 درصد (156 نفر) و فراوانی این ژنوتیپ در میان افراد سالم 6/36 درصد (293 نفر) است. افرادی که در یکی از دو ژن GSTM1 یا GSTT1آنها حذف صورت گرفته در افراد معتاد به هروئین دارای فراوانی 9/52 درصد (234 نفر) و در افراد سالم 5/51 درصد (412 نفر) است. فراوانی افرادی که دارای ژنوتیپ نول در هر دو ژن GSTM1 و GSTT1 هستند، در معتادان به هروئین و گروه شاهد به ترتیب 7/11 (52 نفر) و 7/11 (94 نفر) درصد میباشد.تجزیه و تحلیل آماری نشان داد که اختلاف معناداری بین ژنوتیپ های این چندشکلی و احتمال وابستگی به هروئین بین متغیرهای فوق وجود ندارد.
جدول4-2- توزیع فراوانی



قیمت: تومان

دسته بندی : مقاله و پایان نامه

دیدگاهتان را بنویسید