دانشگاه شيراز
دانشکده دامپزشکي
نيمسال اول سال تحصيل 92 -93 شماره پايان نامه: 1403
پايان نامه براي دريافت درجه دکتراي عمومي دامپزشکي از دانشگاه شيراز
موضوع:
بررسي فنوتيپي و ژنوتيپي هموليزينهاي استافيلوکوکوسهاي جداشده از منابع انساني و گاوي
نگارش:
زهرا مروجي
تقديم و تشکر:
و اينک که به ياري حق و با توان ناچيز تلاشهايم به ثمر نشست
خود را سپاسگزار استاد انديشمندم جناب آقاي دکتر محمد طباطبايي ميدانم
که سخاوت، صبوري، متانت و دورانديشيشان در گنجينه هيچ باوري نگنجد
و نيز مراتب سپاسم را تقديم ميدارم به پيشگاه استادان انديشمندم جناب آقاي دکتر حق خواه و جناب آقاي دکتر درخشنده
و با سپاس ويژه از جناب آقاي دکتر شيرزاد که لحظه به لحظه و گام به گام در طي اين مسير همواره همراه و ياورم بوده اند.
و باز مديون لطف همه عزيزاني هستم که در اين راه ياريم نمودند.
و اما در انتها اين ناچيز نگاشتهها را تقديم ميدارم به
پدر بزرگوارم، مادر هميشه مهربانم و
همسرم که نور ديدگان من است
و خود را تا هميشه مديون مهر و شکيبايي آنان ميدانم
چکيده:
بررسي فنوتيپي و ژنوتيپي هموليزينهاي استافيلوکوکوسهاي جداشده از منابع انساني و گاوي
استافيلوکوکوسها ميکروارگانيسمهايي هستند که در شرايط خاصي ميتوانند عامل ايجاد کننده بسياري از عفونتهاي انسان و حيوان باشند. برخي از سويههاي استافيلوکوکوس ترکيباتي توليد ميکنند که با قدرت بيماريزايي آنها در ارتباط است. يکي از مهمترين آنها هموليزين است. استافيلوکوکوس اورئوس چهار نوع هموليزين آلفا، بتا، گاما و دلتا توليد ميکند. مطالعات مختلفي در مورد هموليزينهاي استافيلوکوکوس اورئوس انجام شده است، اما در ارتباط با ساير جدايههاي دامي و انساني اطلاعات دقيقي در مورد نقش هموليزين در بيماري زايي در دست نيست. لذا هدف از اين مطالعه بررسي انواع هموليزين در گونههاي مختلف استافيلوکوکوس جدا شده از منابع انساني و حيواني بر اساس خصوصيات فنوتيپي و ژنوتيپي است. در اين مطالعه 9 سويه مرجع از سازمان پژوهشهاي علمي و صنعتي ايران تهيه شد و40 جدايه استافيلوکوکوس که 20 مورد منشا گاوي و 20 مورد ديگر منشا انساني داشتند، جمع آوري شدند. پس از تاييد جنس باکتريهاي مورد مطالعه بر اساس تستهاي بيوشيميايي، نوع هموليزين بر اساس ناحيه ايجاد شده توسط هر يک از جدايههاي مختلف روي آگار حاوي خون گوسفند، خرگوش و اسب مشخص گرديد و ژنهاي کد کننده هموليزينهاي مختلف با استفاده از روش واکنش زنجیرهای پلیمراز مورد ارزيابي قرار گرفت. نتايج نشان داد که 31جدايه داراي فعاليت هموليتيک بودند. با بررسي ژنوتيپي هموليزينها مشخص شد که ژن hla و hld در همه جدايهها وجود دارد. ژن hlg در هيچ جدايهاي يافت نشد و 11 جدايه داراي ژن hlb بودند. با بررسي فنوتيپي هموليزينها مشخص شد که بيشتر جدايههاي گاوي هموليز دلتا و بيشتر جدايههاي انساني هموليز آلفا داشتند. نتايج بررسيها نشان داد که هموليزينهاي جدايههاي مختلف استافيلوکوکوس تفاوتهايي از نظر فنوتيپي و ژنوتيپي دارند همچنين تظاهر فنوتيپي هموليزين روي محيط کشت تنها با وجود ژن کد کننده آن امکان پذير است در صورتي که عکس آن صادق نيست و امکان عدم بيان ژن هموليزين وجود دارد
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه و هدف
مقدمه و هدف……………………………………………………………………………………………………………………………………………….1
فصل دوم: کلیات
1 – 2 ریخت شناسی و رنگ آمیزی……………………………………………………………………………………………………………..3
2 – 2 ساختار و ترکیب…………………………………………………………………………………………………………………………………4
3 – 2 ویژگیهای رشد………………………………………………………………………………………………………………………………….4
4 – 2 جداسازی…………………………………………………………………………………………………………………………………………….5
5 – 2 شناسایی و ویژگیهای کلونی…………………………………………………………………………………………………………….6
1 – 5 – 2 تولید رنگدانه……………………………………………………………………………………………………………….6
2 – 5 – 2 همولیز…………………………………………………………………………………………………………………………7
6 – 2 تستهای تشخیص بیماریزایی جدایههای استافیلوکوکوس…………………………………………………………….9
1 – 6 – 2 تست کوآگولاز…………………………………………………………………………………………………………….9
2 – 6 – 2 تست DNase…………………………………………………………………………………………………………..11
3 – 6 – 2 تست تایید وجود پروتئین آ……………………………………………………………………………………..11
7 – 2 جایگاه طبیعی………………………………………………………………………………………………………………………………….12
8 – 2 گونههای استافیلوکوکوس………………………………………………………………………………………………………………..12
1 – 8 – 2 استافیلوکوکوس اورئوس…………………………………………………………………………………………..12
2 – 8 – 2 استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس…………………………………………………………………………………..13
3 – 8 – 2 استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس………………………………………………………………………………14
4 – 8 – 2 استافیلوکوکوس همولیتیکوس…………………………………………………………………………………14
5 – 8 – 2 استافیلوکوکوس سیمولنس………………………………………………………………………………………15
6 – 8 – 2 استافیلوکوکوس لوجاننسیس……………………………………………………………………………………15
7 – 8 – 2 استافیلوکوکوس کپیتیس…………………………………………………………………………………………15
8 – 8 – 2 استافیلوکوکوس زایلوسوس………………………………………………………………………………………16
9 – 8 – 2 استافیلوکوکوس اینترمدیوس…………………………………………………………………………………..16
10 – 8 – 2 استافیلوکوکوس هایکوس………………………………………………………………………………………16
11 – 8 – 2 استافیلوکوکوس سیوری………………………………………………………………………………………..17
12 – 8 – 2 استافیلوکوکوس کروموژنز……………………………………………………………………………………..17
13 – 8 – 2 استافیلوکوکوس لنتوس…………………………………………………………………………………………17
9 – 2 بیماریزایی…………………………………………………………………………………………………………………………….18
10 – 2 نقش استافیلوکوکوس در بیماریهای انسان………………………………………………………………………18
11 – 2 نقش استافیلوکوکوس در بیماریهای حیوان……………………………………………………………………..18
12 – 2 فاکتورهای حدت در استافیلوکوکوس…………………………………………………………………………………19
13 – 2 فاکتورهای حدت در استافیلوکوکوسهای کوآگولاز منفی…………………………………………………19
14 – 2 پاسخ به درمان………………………………………………………………………………………………………………………………20
15 – 2 آزمونهای تشخیص آزمایشگاهی……………………………………………………………………………………….21
1 – 15 – 2 نمونهها………………………………………………………………………………………………………………..21
2 – 15 – 2 تهیه گسترش………………………………………………………………………………………………………21
3 – 15 – 2 کشت……………………………………………………………………………………………………………………21
4 – 15 – 2 تست کاتالاز………………………………………………………………………………………………………….22
5 – 15 – 2 تست کوآگولاز……………………………………………………………………………………………………………….22
6 – 15 – 2 تست حساسیت آنتی بیوتیکی……………………………………………………………………………..22
7 – 15 – 2 تستهای سرمی و تعیین تیپ…………………………………………………………………………….23
فصل سوم: مواد و روشها
1 – 3 مواد و وسایل مورد نیاز………………………………………………………………………………………………………….24
2 – 3 روش کار…………………………………………………………………………………………………………………………………27
1 – 2 – 3 جمع آوری نمونهها………………………………………………………………………………………………….27
2 – 2 – 3 جداسازی استافیلوکوکوس با استفاده از روش کشت………………………………………………27
فصل چهارم: نتایج
نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..36
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………46
پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………50
منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………….51
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1 – 3 چهار جفت پرایمر ژنهای مولد همولیزین در استافیلوکوکوس…………………………………..32
جدول 1 – 4 نتايج تستهاي بيوشيميايي و مولکولي نمونههاي کنترل…………………………………………..37
جدول 2 – 4 نتايج تستهاي بيوشيميايي و مولکولي جدايههاي گاوي……………………………………………38
جدول 3- 4 نتايج تستهاي بيوشيميايي و مولکولي جدايههاي انساني…………………………………………39
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 1 – 4 میزان درصد فراواني انواع همولیز بر اساس ژنوتيپ……………………………………………………..43
نمودار 2 – 4 میزان درصد فراواني انواع همولیز بر اساس فنوتيپ…………………………………………………….43
نمودار 3 – 4 مقایسه درصد فراوانی همولیزین های انسانی و گاوی بر اساس ژنوتیپ……………………..44
نمودار 4 – 4 مقایسه درصد فراوانی همولیزین های انسانی و گاوی بر اساس فنوتیپ……………………..44
نمودار 5 – 4 میزان درصد فراوانی فعالیت همولیتیک و غیر همولیتیک…………………………………………..45
فهرست تصاویر
عنوان صفحه
تصوير 1 – 3 هموليز کامل در استافيلوکوکوس………………………………………………………………………………….30
تصوير 1 – 4 کوکسي گرم مثبت خوشه انگوري استافيلوکوکوس در زير ميکروسکوپ……………………40
تصوير 2 – 4 تست اکسيداز منفي استافيلوکوکوس……………………………………………………………………………40
تصوير 3 – 4 تست کاتالاز مثبت در استافيلوکوکوس………………………………………………………………………..40
تصوير 4 – 4 تست کوآگولاز در لوله…………………………………………………………………………………………………40
تصوير 5 – 4 رشد روي مانيتول سالت آگار………………………………………………………………………………………..40
تصوير 6 – 4 هموليز بتا، هموليز دوتايي و بدون هموليز……………………………………………………………………41
تصوير 7 – 4 هموليز دلتا…………………………………………………………………………………………………………………….41
تصوير 8 – 4 هموليز دوتايي و آلفا……………………………………………………………………………………………………41
تصوير 9 – 4 تشديد هموليز در محل برخورد هموليز بتا و دلتا………………………………………………………..42
تصوير 10 – 4 مقايسه هموليز ايجادي روي محيط کشت حاوي خون گوسفند و اسب…………………..42
تصوير 11 – 4 عکس UV از محصولات واکنش زنجیرهای پلیمراز……………………………………………………42
مقدمه و هدف
اعضاي جنس استافيلوكوكوس ميكروارگانيسمهايي هستند كه گونههاي مختلفي را شامل ميشوند. هريك از اين گونهها ميتوانند عامل ايجاد كننده بسياري از عفونتهاي شناخته شده باشند. استافيلوكوكوسها ميتوانند از طريق محيط روي پوست، غشاهاي مخاطي و ديگر اعضاي بدن انسان و حيوان ساكن شوند (گان، 1989). اين ميكروارگانيسمها را ميتوان به 2 دسته کواگولاز مثبت و کواگولاز منفي تقسيم كرد. کواگولاز منفيها ميكروارگانيسمهاي فرصت طلبي هستند كه در شرايط خاصي در بدن انسان و حيوان عفونتهاي شديدي را ايجاد ميکنند و اغلب عامل اوليه بيماري در انسان و دامها محسوب ميشوند و بيماريهايي از قبيل عفونتهاي مجاري ادراري، رودهاي، گوش، ورم پستان، استئوميليت، اندوكارديت، منن‍‍‍ژيت، ذات الريه، ضايعات سطحي مانند فورونكولوز و بسياري بيماريهاي ديگر را ايجاد ميکنند (گان، 1989 و ترکيالماز، 2005).
استافيلوکوکوس اورئوس1يكي از عوامل مهم عفونت پستان در گاو بوده و به عنوان پاتوژن مهم انساني نيز شناخته ميشود (ايسمون و ادلام، 1983 و آرستراپ، 1995). استافيلوکوکوس اورئوس تركيبات مختلفي را توليد ميكند که با قدرت بيماريزايي آن در ارتباط هستند، که يكي از مهمترين آنها هموليزين است. هموليزين استافيلوكوكوسها به عنوان يكي از مهمترين عوامل حدت باكتري شناخته شده است كه در تهاجم باكتري و فرار باكتري از دسترسي سيستم دفاعي بدن شركت ميكند (اندرسون، 1976 و ايندولو، 1989).
استافيلوکوکوس اورئوس چهار نوع هموليزين آلفا (α)، بتا (β)، گاما (γ) و دلتا (δ) را توليد ميكند كه بررسي نقش اين هموليزينها به عنوان عوامل حدت در مطالعات مختلفي نشان داده شده است (ويسمان، 1975 و آربوثنوت، 1981).
توكسين آلفا به دليل اثرات هموليتيك، درمونكروتيك و نوروتوكسيك به عنوان فاكتور اصلي بيماريزايي استافيلوكوكوس شناخته ميشود. توكسين بتا (هموليزين بتا) حاوي اسفنگوميليناز بوده كه عليه گلبولهاي قرمز گوسفند و گاو فعال است، اما برخلاف توكسين آلفا نقش توكسين بتا در قدرت بيماريزايي اين ميكروارگانيسم كمتر به اثبات رسيده است (داسيلوا و همکاران، 2005).
با توجه به اينكه مطالعات مختلفي نشان داده است كه هموليزينهاي استافيلوکوکوس اورئوس ارتباط خاصي با ايجاد تورم پستان دارند، اما در ارتباط با ساير جدايههاي دامي و انساني اطلاعات دقيقي در مورد نقش هموليزين دربيماريزايي در دست نيست، لذا هدف از اين مطالعه بررسي انواع هموليزين درگونههاي مختلف استافيلوكوكوس جدا شده از منابع انساني وحيواني بر اساس خصوصيات فنوتيپي و ژنوتيپي است.
کليات
استافيلوکوکوس يک باکتري کروي شکل گرم مثبت است که در زير ميکروسکوپ بهصورت خوشههاي نامنظم شکل ميگيرد. اين ميکروارگانيسم در قسمت فوقاني دستگاه تنفس و سطوح پوششي بيني، نوک پستان، واژن حيوانات خونگرم وجود دارد. تاکنون 50 گونه و زيرگونه استافيلوکوکوس شناسايي شده است. استافيلوکوکوسها بر اساس تواناييشان در لخته کردن پلاسما به دو دسته کوآگولاز مثبت و کوآگولاز منفي تقسيم مي شوند (پيورالا و تاپونن، 2009).
استافيلوکوکوس عامل ايجادکننده بسياري از عفونتهاي فرصت طلب در انسان و حيوان شناخته شده است و در آزمايشگاه ميکروب شناسي باليني مهم ترين پاتوژن جدا شده از عفونتها محسوب ميشود (يوگروس و همکاران، 2000).
1-2- ريخت شناسي و رنگ آميزي:
نام استافيلوکوکوس از لغت يوناني استافيل به معناي خوشه انگور گرفته شده است. علت اين نامگذاري رشد کوکسيهاي گرم مثبت در يک الگوي شبيه به خوشه انگور ميباشد (موري و همکاران، 2009).
استافيلوکوکوسها سلولهاي کروي شکل به قطر 1 ميکرون هستند که در دستههاي نامنظم شکل ميگيرند. کوکسي تازه آن در رنگ آميزي گرم به شدت گرم مثبت است و در کشت کهنه بسياري از سلولهاي آن گرم منفي رنگ ميگيرند. استافيلوکوکوسها غيرمتحرک و فاقد اسپور هستند (بروکس و همکاران، 2010).
2-2- ساختار و ترکيب:
ديواره سلولي استافيلوکوکوسها شامل پروتئين و پليساکاريد است. يک پروتئين با عنوان فاکتور تودهاي کننده2وجود دارد که در شرايط آزمايشگاهي با فيبرينوژن فعل و انفعالاتي انجام ميدهد و ايجاد يک واکنش آگلوتيناسيون ميکند. پروتئين ديگر، پروتئين آ است که با ترکيب شدن با قطعه FC ايمنوگلوبولينها تودهاي را تشکيل ميدهد. عمده پليساکاريد ديواره سلولي اسيد تيکوئيک متصل به پپتيدوگليکان است. رنگدانههاي کاروتنوئيد در ديواره سلولي ميتواند رنگ طلايي را در کلونيهاي استافيلوکوکوس اورئوس ايجاد کند. گاهي اوقات استافيلوکوکوس اورئوس کپسول توليد ميکند و گاهي نيز يک کپسول کاذب که به سستي در ارتباط با يک ساختار کربوهيدرات است توسط سويههايي که ايجاد ورم پستان در گاو ميکنند، توليد ميشود (هيرش و همکاران، 2004).
3-2- ويژگيهاي رشد:
استافيلوکوکوسها به راحتي در اکثر محيطهاي کشت باکتري تحت شرايط هوازي و ميکروائروفيل رشد ميکنند. اکثر گونههاي آن بيهوازي اختياري اند و در محيط حاوي 10% کلريد سديم و محدوده دمايی C° 18-40 رشد ميکنند. محيط معمول براي تلقيح نمونهها محيط آگارحاوي خون گاو يا گوسفند ميباشد. محيط برد – پارکر آگار و مانيتول سالت آگار محيط انتخابي استافيلوکوکوس محسوب ميشود که معمولا در ميکروب شناسي مواد غذايي کاربرد دارند. اين ميکروارگانيسم در دمای C° 37 به سرعت رشد ميکند، اما تشکيل رنگدانه در دماي اتاق (C° 25-20) بهتر شکل ميگيرد. کلونيها روي محيط جامد گرد، صاف، برجسته و براق هستند (کويين و همکاران، 1994).
استافيلوکوکوس اورئوس معمولا کلونيهاي خاکستري تا زرد طلايي ايجاد ميکند. استافيلوکوکوس اپيدرميديس3 معمولا کلونيهاي خاکستري تا سفيد رنگ در جداسازي اوليه توليد ميکند. بسياري از کلونيها در اثر گرمخانه گذاري طولاني مدت توليد رنگدانه ميکنند. در محيط مايع و در شرايط بيهوازي هيچ رنگدانهاي توليد نميشود. درجات مختلفي از همموليز توسط استافيلوکوکوس اورئوس و گاهي توسط گونههاي ديگر توليد ميشود. استافيلوکوکوسها به آرامي بسياري از کربوهيدراتها را تخمير ميکنند و توليد اسيد لاکتيک بدون ايجاد گاز ميکنند. فعاليت پروتئوليتيک از سويهاي به سويه ديگر متفاوت است (بروکس و همکاران، 2010).
4-2- جداسازي:
محيط کشت آگار حاوي خون گاو بهترين محيط براي تشخيص توکسين β است که اين خود عامل تشخيصي براي استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز مثبت از جمله استافيلوکوکوس اينترمديوس4، استافيلوکوکوس شليفري5 و استافيلوکوکوس اورئوس مي باشد (هيرش و همکاران، 2004).
براي جداسازي ارگانيسمها از نمونههاي بسيار آلوده، نمونهها را ميتوان روي محيط CNA6 و يا PEA7 تلقيح کرد. اين دو محيط مانع از رشد باکتريهاي گرم منفي ميشوند و به باکتريهاي گرم مثبت اجازه رشد ميدهند. مانيتول سالت آگار يک محيط انتخابي مناسب براي ارزيابي حضور استافيلوکوکوس اورئوس در نمونههايي از قبيل نمونههاي اخذ شده از بيني ميباشد. در محيط کشت آگار حاوي خون گوسفند اکثر استافيلوکوکوسها در مدت 24 ساعت به خوبي رشد ميکنند. بعضي از گونههاي استافيلوکوکوس ممکن است بر اساس اين که نمونه حاوي کشت خالص است يا مخلوط به بيش از 48-24 ساعت گرمخانه گذاري نياز داشته باشند (وين و همکاران، 2006).
5-2- شناسايي و ويژگيهاي کلوني:
کلونيهاي اکثر گونههاي استافيلوکوکوس بعد از 24 ساعت گرمخانه گذاري قطر 3-1 ميلي متر و يا کمتر دارند. کلونيهاي استافيلوکوکوس معمولا گرد، صاف، کروي، برجسته، براق و داراي مقطع عرضي محدب و حاشيه مشخص ميباشند. کلونيهاي بعضي سويههاي استافيلوکوکوس اورئوس معمولا بزرگ، صاف و کروي هستند، در حالي که بعضي سويهها ممکن است ظاهري خيس و چسبناک داشته باشند.
1-5-2- توليد رنگدانه:
استافيلوکوکوسها در دماي اتاق بهتر رنگدانه توليد ميکنند. بعضي سويههاي استافيلوکوکوس اورئوس ممکن است رنگدانه زرد يا زرد – نارنجي توليد کنند، در حالي که ديگر سويههاي آن کلونيهاي سفيد يا خاکستري فاقد رنگدانه توليد ميکنند. گفته شده است تشديد توليد رنگدانه در استافيلوکوکوس توسط اضافه کردن شير، چربي يا گليسرول مونواستات به محيط کشت القا ميشود. کلونيهاي استافيلوکوکوس اپيدرميديس در جداسازي اوليه معمولا خاکستري تا سفيد هستند. بسياري از کلونيها همراه با گرمخانه گذاري طولاني مدت توليد رنگدانه ميکنند. در محيط مايع و فاقد اکسيژن هيچ رنگدانهاي توليد نميشود (وين و همکاران، 2006 و بروکس و همکاران، 2010). کلونيهاي سويههاي استافيلوکوکوس اورئوس در انسان و گاو زرد طلايي هستند. کلونيهاي بعضي از استافيلوکوکوسهاي کواگولاز منفي نيز داراي رنگدانه هستند (کويين و همکاران، 1994).
2-5-2- هموليز:
استافيلوکوکوس اورئوس چهار نوع هموليزين آلفا (α)، بتا (β)، گاما (γ) و دلتا (δ) را توليد ميكند كه بررسي نقش اين هموليزينها بهعنوان عوامل حدت در مطالعات مختلفي نشان داده شده است (ويسمان، 1975 وآربوثنوت، 1981). اكثر سويههاي حاد استافيلوکوکوس اورئوس كه ازمنابع انساني جدا شدهاند توليد توكسين α ميكنند (الک و لوي، 1950)، همچنين جدايههاي مولد توكسين آلفا با تورم پستان قانقاريايي در گاو نيز در ارتباط ميباشند و مطالعات مختلف در موش و خرگوش نشان داده كه موتانتهايي كه قادر به توليد توكسين آلفا نيستند داراي قدرت بيماريزايي كمتري بوده و انجام واكسيناسيون با توكسين آلفا، باعث محافظت ميزبان ميشود (ادلام و همکاران، 1977، جانسون و همکاران، 1985 و منزيس و کرنودل، 1996).
توکسين آلفا يک پروتئين ناهمگون است که بر روي طيف گستردهاي از غشاي سلولهاي يوکاريوت موثر است. توکسين آلفا يک هموليزين قوي است. توکسين بتا اسفنگوميلين را تخريب کرده و براي بسياري از سلولها از قبيل گلبولهاي قرمز انسان اثرات کشنده دارد. توکسين دلتا ناهمگون بوده و در مجاورت پاک کنندههاي غير يوني، به چند زير واحد شکسته ميشود، غشاهاي بيولوژيک را پاره ميکند و احتمالا در بيماريهاي اسهالي استافيلوکوکوس اورئوس نقشي بر عهده دارد. هموليزين گاما به مجموعهاي از سه پروتئين گفته ميشود که با دو پروتئين از لکوسيدين پنتون – والنتين8 ترکيب شده و شش پروتئين دوجزئي با توانايي بالقوه سميت را به وجود ميآورد. تمامي اين شش توکسين پروتئيني از راه به وجود آمدن منفذ در غشاهاي سلولي، بهگونهاي موثر گلبولهاي سفيد را ليز کرده و سبب نفوذپذيري آنها نسبت به کاتيونها ميشود (بروکس و همکاران، 2010).
هموليزينهاي استافيلوکوکوس (,β,γ,δα) ميتوانند به تنهايي و يا در ترکيب با هم توليد شوند و يا هرگز توليد نشوند. هموليزينها از لحاظ آنتي ژني، بيوشيميايي و اثرشان بر روي گلبول هاي قرمز گونههاي مختلف حيوانات متفاوت هستند. محيط کشت حاوي اريتروسيتهاي گاو و گوسفند در کارهاي تشخيصي دامپزشکي نسبت به خون ساير حيوانات ترجيح داده ميشود. به علت اينکه گلبولهاي قرمز اين دو گونه حيوان به هموليزينهاي α و β که به طور رايج از جدايههاي استافيلوکوکوس حيواني جدا ميشوند، حساس است. معمولا استافيلوکوکوس اورئوس و استافيلوکوکوس اينترمديوس هر دو هموليتيک هستند و اغلب هموليز α و β و همچنين هموليز دوتايي را نشان ميدهند. استافيلوکوکوسهاي کواگولاز منفي توانايي متفاوتي در توليد هموليز که معمولا به آهستگي ايجاد ميشوند، دارند. جدايههاي استافيلوکوکوس هايکوس9 فاقد هموليز هستند (کويين و همکاران، 1994).
بهطور كلي بر اساس مطالعات انجام شده نتايج ترشح هموليزين بهصورت زير مشخص ميشود:
الف) ناحيه هموليز كامل با لبههاي نا مشخص روي پليت حاوي خون گوسفند و خرگوش مشخص كننده هموليزين آلفا ميباشد.
ب) ناحيه تيره اطراف كلنيها روي پليت حاوي خون گوسفند كه بعد از قرار گرفتن در يخچال كامل ميشود، بهعنوان هموليز بتا شناخته ميشود.
ج) منطقه هموليز كامل با لبههاي كاملاً واضح و مشخص روي پليت حاوي خون گوسفند، خرگوش و اسب مشخص كننده وجود هموليزين دلتا است.
د) در نهايت هموليزين گاما بر اساس توليد يك ناحيه كوچك از هموليز ناقص روي پليت حاوي خون خرگوش مشخص ميشود. قابل توجه است كه اين نوع هموليزين روي پليت حاوي خون گوسفند و اسب اثرات مشخصي را ايجاد نميكند (هاک و بالدوين، 1964).
6-2- تستهاي تشخيص بيماريزايي جدايههاي استافيلوکوکوس:
1-6-2- تست کوآگولاز:
استافيلوکوکوس اورئوس، آنزيم کوآگولاز را توليد ميکند. اين پروتئين يک شبه آنزيم است که پلاسماي سيتراته يا اگزالاته را لخته مي کند. کوآگولاز به پروتئين، پيوند ميشود، مجموعه کوآگولاز و پروترومبين از نظر آنزيمي فعال ميشود و پليمريزه شدن فيبرين را شروع ميکنند.کوآگولاز احتمالا موجب رسوب فيبرين در سطح استافيلوکوکوسها ميشود. احتمالا رسوب فيبرين باعث جلوگيري از بلعيده شدن باکتريها در سلولهاي بيگانه خوار و يا جلوگيري از تخريب آنها در درون اين سلولها ميگردد. توليد کوآگولاز به مفهوم توانايي بالقوه در قدرت تهاجمي و بيماري زايي است.
دو روش براي تست کوآگولاز انجام ميشود:
الف) اسلايد
ب) لوله
برخي از استافيلوکوکوسهاي پاتوژن ممکن است تست کوآگولاز آنها روي اسلايد منفي شود، اما در لوله مثبت شود. برخي از آزمايشگاهها تنها تست لوله را براي کوآگولاز انجام ميدهند.
براي انجام اين تست ميتوان از کلونيهاي رشد يافته روي محيط آگار CNA، آگار حاوي خون يا ديگر محيطهاي غير انتخابي مغذي استفاده کرد، اما نبايد محيطهاي با غلظت بالاي نمک مانند مانيتول سالت آگار باشد، زيرا غلظت بالاي نمک باعث ميشود بعضي سويههاي استافيلوکوکوس اورئوس به طور خودبهخودي ايجاد لخته کنند (وين و همکاران، 2006).
پلاسماي تازه يا فريز و خشک شده تجاري معرفي است که مورد استفاده قرار ميگيرد. پلاسماي خرگوش حاوي فيبرينوژن است که توسط آنزيمهاي کوآگولاز استافيلوکوکوس به فيبرين تبديل ميشود. کوآگولاز متصل با واسطه سلولي بوده و روي لام آزمايش ميشود و کوآگولاز آزاد که در محيط رشد باکتري آزاد ميشود، با تست لوله شناسايي ميشوند.
مادهاي که براي انجام کوآگولاز لوله و اسلايد توصيه ميشود، پلاسماي خرگوش با EDTA10 است. پلاسماي سيتراته نبايد استفاده شود، زيرا ارگانيسمهايي که قادر به استفاده از سيترات هستند (براي مثال گونههاي انتروکوکوس) اگر با استافيلوکوکوس اشتباه گرفته شوند، نتايج مثبت کاذب را نشان ميدهند. ميتوان با انجام تست کاتالاز از اين خطا جلوگيري کرد. پلاسماي انساني (براي مثال مواد از تاريخ گذشته بانکهاي خوني) شامل مقادير متفاوتي از CRF11 وآنتي باديهاي ضد استافيلوکوکوس است و نبايد در تست کوآگولاز استفاده شوند (وين و همکاران، 2006).
الف)تست کوآگولاز روي اسلايد:
يک لوپ پر از کشت استافيلوکوکوس در يک قطره آب روي لام حل ميشود. يک لوپ پر از پلاسماي خرگوش اضافه شده و به خوبي با سوسپانسيون باکتريايي مخلوط ميشود. اسلايد به آرامي تکان داده ميشود. اگر پس از 2-1 دقيقه لخته شد، نشان دهنده واکنش مثبت است (کويين و همکاران، 1994).
ب) تست کوآگولاز در لوله:
براي اين منظور 5/0 ميلي ليتر از پلاسماي خرگوش در يک لوله کوچک آزمايش ريخته ميشود و سپس 2 قطره از محيط مايع کشت شبانه استافيلوکوکوس و يا از سوسپانسيون غليظ باکتري در محيط کشت آگار در آب استريل به آن اضافه ميشود. لوله را به آرامي ميچرخانيم تا محتويات آن مخلوط شوند و سپس در دمايC° 37 ترجيحا در حمام آب گرم گرمخانه گذاري ميشود. تست مثبت با لخته شدن پلاسما پس از 4-2 ساعت اتفاق ميافتد، اما در سويههايي که کوآگولاز مثبت ضعيف هستند پلاسما تنها پس از يک شبانه روز گرمخانه گذاري لخته ميکنند (کويين و همکاران، 1994).
2-6-2- تست DNase:
اين تست شاخص معتبري براي بيماريزايي نميباشد زيرا تخمين زده شده است که حدود 18% از استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز منفي فعاليت DNase دارند (کويين و همکاران، 1994). استافيلوکوکوس اورئوس DNase توليد ميکند و اسید نوکلوئيک را هيدروليز ميکند. DNase با تلقيح نقطهاي کلونيهاي ارگانيسم روي آگار DNase تشخيص داده ميشود (وين و همکاران، 2006).
3-6-2- تست تاييد وجود پروتئين آ12:
کيت هاي تجاري از قبيل SeroSTAT در دسترس است. اين تست در آزمايشگاههاي تشخيص پزشکي بيشتر مورد استفاده قرار ميگيرد (کويين و همکاران، 1994).
7-2- جايگاه طبيعي:
اگرچه شيوع سويههاي استافيلوکوکوس بين گونههاي مختلف حيوانات محدود است، اما عفونتهاي استافيلوکوکوس در پستانداران در سراسر جهان رخ ميدهد. اين ميکروارگانيسمها در فضاي بيني، پوست و غشاي مخاطي ساکن ميشوند و ميتوانند به مجاري روده انتقال يابند. عفونتهاي بسياري در طبيعت به صورت غيرمستقيم منتقل ميشود (کويين و همکاران، 1994).
8-2- گونههاي استافيلوکوکوس:
1-8-2- استافيلوکوکوس اورئوس:
گونه کوآگولاز مثبت استافيلوکوکوس اورئوس عامل اصلي بسياري از عفونتهاي جدي حاصله از بيمارستان و اجتماع ميباشد. اين گونه ميتواند روي پوست و قسمت جلويي سوراخ بيني هر فردي ساکن شود و توسط بخش اعظمي از جامعه حمل شود. استافيلوکوکوس اورئوس فاکتورهاي حدت بسياري دارد که ميتواند عفونتهايي را در بسياري از قسمتهاي مختلف بدن ايجاد کند. رايج ترين اين عفونتها، ابتدا عفونت پوست و بافت نرم از قبيل سلوليت، زرده زخم13 و آبسههاي بافت نرم و سپس عفونت بيماران ديابتي است. استافيلوکوکوس اورئوس همچنين عامل اصلي عفونتهاي استخوان و مفصل مانند استئوميليت حاد مهرهاي اغلب در اثر آلودگيهاي حين جراحي ميباشد (وين و همکاران، 2006).
استافيلوکوکوس اورئوس علت عمده ابتلا و مرگ در بيماران کليوي است. در حقيقت علت عمده تجزيه خون، باکترمي ميباشد. همانند استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز منفي ، استافيلوکوکوس اورئوس عامل اصلي اندوکارديت دريچهاي خودي و مصنوعي ميباشد. ديگر عفونتهاي ايجاد شده توسط استافيلوکوکوس اورئوس شامل پريتونيت، پيلونفريت و آبسههاي ريوي است.
از اين موارد بيماريزايي، توانايي استافيلوکوکوس اورئوس براي توليد توکسينهاي متنوع، اتصال محکم به مواد مصنوعي، توليد يک گليکوکاليکس و توانايي غيرعادي آن براي ايجاد مقاومت ضد ميکروبي استنتاج ميشود (کسي و همکاران، 2007).
سويههاي حيواني استافيلوکوکوس اورئوس بيماريزاهاي مهمي در دامپزشکي محسوب ميشوند که بيماريهايي در گاو، نشخوارکنندگان کوچک، ماکيان، خرگوش، خوک، اسب و در ديگر گونههاي حيوانات ايجاد ميکند. استافيلوکوکوس اورئوس در گاو و نشخوارکنندگان کوچک يکي از عوامل اصلي ورم پستان محسوب ميشود. عفونتهاي مفصل، استئوميليت و سپتيسمي به علت استافيلوکوکوس اورئوس در ماکيان توصيف شده است (گايلس و همکاران،2010).
2-8-2- استافيلوکوکوس اپيدرميديس:
این باکتری از نظر تست احیای نیترات، مثبت ضعیف است. آنزیم اوره‌آز را تولید کرده اما اکسیداز منفی است. باکتری، قندهای گلوکز، سوکروز و لاکتوز را مصرف کرده و از آن‌ها اسید تولید می‌کند. این باکتری، بخشی از فلور همزیست پوست انسان است و در غشای مخاطی بسیاری از جانوران نیز دیده شده‌است. استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس یکی از شایع ترین گونه‌های آلوده کننده محیط‌ها و تست‌های آزمایشگاهی است (کوئک و اتو، 2008). اگرچه این باکتری بطور معمول بیماریزا نیست اما توانایی ایجاد عفونت در افرادی که سیستم ایمنی آن‌ها ضعیف شده ‌است را دارد. این عفونت‌ها می‌توانند بیمارستانی یا اکتسابی از جامعه باشند اما نوع بیمارستانی آن، خطر بیشتری برای بیماران دارد (سالیرز و همکاران، 2002). عفونتهاي ناشي از استافيلوکوکوس اپيدرميديس شامل موارد زير است:
اندوکارديت دريچههاي خودي و مصنوعي، عفونتهاي سوند داخل عروقي، عفونتهاي مايع مغزي نخاعي، پريتونيت وابسته به سوند دياليز پريتونيوم، باکترمي، استئوميليت، عفونتهاي پيوند عروق، عفونتهاي مفصل مصنوعي و عفونتهاي مجاري ادراري (وين و همکاران، 2006)
3-8-2- استافيلوکوکوس ساپروفيتيکوس14:
گونه کوآگولاز منفي استافيلوکوکوس ساپروفيتيکوس يک بيماريزاي تاييد شده است که عفونتهاي حاد مجاري ادراري در زنان جوان ايجاد ميکند. در اين جمعيت استافيلوکوکوس ساپروفيتيکوس دومين عامل مهم بعد از اشریشيا کلي15 در التهاب مثانه است. اين ارگانيسم همچنين موجب پيلونفريت در التهاب ميزراه در زنان و مردان و عفونتهاي مجاري ادراري وابسته به سوند در مردان مسن ميشود (وين و همکاران، 2006).
4-8-2- استافيلوکوکوس هموليتيکوس16:
استافيلوکوکوس هموليتيکوس بخشي از فلور نرمال انسان و ساير پريماتها ميباشد. اين ارگانيسم به عنوان عامل عفونتهاي بافت نرم و زخم، عفونتهاي مجاري ادراري، عفونتهاي نوزادان، عفونت غده پستاني گاو و عفونت مجاري ادراري بز شناخته شده است (انثونيسن و همکاران، 2002).
5-8-2- استافيلوکوکوس سيمولنس17:
استافيلوکوکوس سيمولنس روي پوست و در ميزراه زنان سالم يافت ميشود. اين ارگانيسم به عنوان علت سپتيسمي، استئوميليت، اندوکارديت دريچه خودي، آرتريت عفوني به دنبال احياي باز استخوان شکسته نازک ني، استئوميليت مهرهاي و عفونت مفصل مصنوعي جدا شده است (وين و همکاران، 2006).
6-8-2- استافيلوکوکوس لوجاننسيس18:
استافيلوکوکوس لوجاننسيس عفونتهاي متنوع بسياري را ايجاد ميکند، از جمله: اندوکارديتهاي دريچهاي خودي – مصنوعي و وابسته به ضربان پيشاهنگ، مننژيت، آبسههاي پوست و بافت نرم، سلوليت، پريتونيت، عفونت مفصل مصنوعي ران، استئوميليت، التهاب ديسک بين مهرهاي، عفونت خطوط عروقي، عفونت دهان، عفونت مفاصل به دنبال جراحي آرتروسکوپي، عفونتهاي مجاري ادراري و عفونتهاي شانت محوطه بطني – شکمي را ايجاد ميکند (وين و همکاران، 2006).
7-8-2- استافيلوکوکوس کپيتيس19:
استافيلوکوکوس کپيتيس بخشي از فلور ميکروبي طبيعي انسان است و اطراف غدههاي چربي در پوست سر و پيشاني يافت ميشود. از سال 1992 اين گونه به عنوان علت اندوکارديت دريچه خودي و مصنوعي (شامل اندوکارديت دريچه آئورت) و اندوکارديت وابسته به اندوسکوپي فوقاني و پيوند دستگاه تنظيم کننده ضربان قلب گزارش شده است. اين ميکروارگانيسم به عنوان عامل عفونت خوني در نوزادان نابالغ بيمار با وضعيت بحراني (شامل مننژيت) تاييد شده است (وين و همکاران، 2006).
8-8-2- استافيلوکوکوس زايلوسوس20:
استافيلوکوکوس زايلوسوس در انسان و ساير پريماتها يافت ميشود و به عنوان علت عفونتهاي مجاري ادراري فوقاني و تحتاني و اندوکارديت وابسته به استفاده از داروهاي داخل رگي گزارش شده است. اين ميکروارگانيسم همچنين از شير و پنير بز جدا شده است (وين و همکاران، 2006).
9-8-2- استافيلوکوکوس اينترمديوس:
اين گونه به عنوان بخشي از فلور طبيعي سگ، راسو، اسب و گربه شناخته شده است. ممکن است عفونتهاي جلدي، مجاري ادراري، استخوان و سيستم اعصاب مرکزي را در اغلب حيوانات ايجاد کند (وين و همکاران، 2006).
10-8-2- استافيلوکوکوس هايکوس:
استافيلوکوکوس هايکوس در گاو و شير آن يافت شده است و در ارتباط با اپيدرميت اگزوداتيو21 (سندرم خوک چرب)، يک بيماري حاد خوکهاي شيرخوار و تازه از شير گرفته شده، ميباشد. سويههاي ايجاد کننده اين عفونت پوستي 3 نوع توکسين اکسفولياتيو22 و يک آنزيم ليپاز – فسفوليپاز خارج سلولي وابسته به کلسيم توليد ميکنند که در بيماريزايي اين باکتري شرکت ميکنند (وين و همکاران، 2006).
11-8-2- استافيلوکوکوس سيوري:
استافيلوکوکوس سيوري به صورت وسيع در طبيعت گسترده شده است و از غذا، حيوانات اهلي، جوندگان، کيسهداران، پستانداران دريايي و گاهي اوقات از انسانها و حيوانات خانگيشان جدا شده است (وين و همکاران، 2006).
12-8-2-استافيلوکوکوس کروموژنز23:
اين گونه قبلا زير گونه استافيلوکوکوس هايکوس بوده است و عفونتهاي پوستي در گاو، خوک و بز ايجاد ميکند (وين و همکاران، 2006). استافيلوکوکوس کروموژنز از پوست نوک پستانک، مجراي پستانک و غدههاي پستاني تليسههايي که سن آنها زير 10 ماه است، جدا شده است. اين ميکروارگانيسم همچنين در قسمتهاي ديگر بدن مانند سوراخ بيني، پوشش مويي، واژن و مجاري سر پستانک تليسهها ساکن ميشوند (پيورالا و تاپونن، 2009).
13-8-2- استافيلوکوکوس لنتوس24:
استافيلوکوکوس لنتوس قبلا زيرگونه استافيلوکوکوس سيوري25 بوده است و جزء فلور طبيعي پوست گوسفند و بز محسوب ميشود (وين و همکاران، 2006). در ميان همه زير گونه‌هاي استافيلوکوکوس سيوري، فقط استافيلوکوکوس لنتوس توانايي استفاده از تريساکاريد رافينوز را دارد (کلوس و همکاران، 1997). استافيلوکوکوس لنتوس،کوکسي گرم مثبت، اکسيداز مثبت و کواگولاز منفي است ( استپانويک و همکاران، 2005).
9-2- بيماريزايي:
استافيلوکوکوسها باکتريهاي تبزا هستند و تشکيل آبسه و چرک ميدهند. چرک شامل باقي مانده لوکوسيتهاي مرده و باکتريهاي زنده و مرده است که توسط سلولهاي فاگوسيتي سالم و لايههاي فيبرين احاطه ميشوند و در نهايت يک کپسول فيبريني اطراف آبسه تشکيل ميشود (کويين و همکاران، 1994).
توانايي بيماريزايي استافيلوکوکوس اورئوس در ترکيب اثرات فاکتورهاي خارج سلولي و توکسينها است که با هم خصوصيات تهاجمي به آن ميدهد. استافيلوکوکوس اورئوس مهاجم و بيماريزا، کوآگولاز و رنگدانه توليد ميکند و هموليتيک است. استافيلوکوکوسهاي غير بيماريزا و غيرمهاجم از قبيل استافيلوکوکوس اپيدرميديس کوآگولاز منفي و غيرهموليتيک هستند. اين ارگانيسمها به ندرت توليد چرک ميکنند. ممکن است آنها به جهت توليد بيوفيلم به درمان مقاوم باشند. استافيلوکوکوس ساپروفيتيکوس معمولا رنگدانه توليد نميکند و غيرهموليتيک و مقاوم به نووبيوسين است (بروکس و همکاران، 2010).
10-2- نقش استافيلوکوکوس در بيماريهاي انسان:
استافيلوکوکوس بيماريهاي مختلفي از جمله عفونتهاي پوست و بافت نرم، عفونتهاي زخم، باکترمي و اندوکارديت عفوني، عفونتهاي سوندهاي داخل عروقي، درگيري سيستم اعصاب مرکزي، عفونتهاي مجاري تنفسي، عفونتهاي مجاري ادراري، استئوميليت و آرتريت، بيماريهاي چشم و سندرمهاي با واسطه توکسين را در انسان ايجاد ميکند.
11-2- نقش استافيلوکوکوس در بيماريهاي حيوانات:
از جمله بيماريهايي که اين جنس در حيوانات ايجاد ميکند، شامل موارد زير است:
آلودگي با کنه در برهها26، اندومتريت، پيودرما، اپيدرميت اگزوداتيو، ورم پستان، استافيلوکوکوزيس در ماکيان
12-2- فاکتورهاي حدت در استافيلوکوکوس:
فاکتورهاي حدت استافيلوکوکوس اورئوس و استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز منفي با اندازهگيري بيان فنوتيپي توليداتي که به نظر ميرسد در ارتباط با حدت هستند و همچنين غربالگري ژنهاي کد کننده اين توليدات مورد بررسي قرار گرفته است. فاکتورهاي حدت بسياري شامل توليد هموليزين، لوکوسيدين، توکسينهاي اکسفولياتيو، توکسينهاي رودهاي، توکسين سندرم شوک سمي و توانايي توليد مواد چسبنده و بيوفيلم در سويههاي استافيلوکوکوس اورئوس جداشده از ورم پستان يافت شده است (هاوري و همکاران، 2008).
13-2- فاکتورهاي حدت در استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز منفي:
در سال 1972 توليد مواد چسبنده توسط استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز منفي به عنوان يک فاکتور مهم در بيماريزايي ذکر شد (هوبنر و گلدمن، 1999). مواد چسبنده يا بيوفيلم مهمترين فاکتور حدت در استافيلوکوکوس اپيدرميديس ميباشد. تشکيل بيوفيلم اتصال و ماندگاري باکتري را بر روي مواد بيگانه ممکن ميسازد. به علاوه يک باکتري که بيوفيلم تشکيل ميدهد از تاثير آنتي بيوتيک و سيستم ايمني در امان است (مک و همکاران، 2007). فاکتور حدت ديگر در استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز منفي مقاومتهاي آنتيبيوتيکي است (مک و همکاران، 2007). تنوع فنوتيي و بيان ژنهاي ناهمگن استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز منفي به خصوصاستافيلوکوکوس اپيدرميديس يک مزيت براي سازش با شرايط متغير محيطي است (زيبور و همکاران، 2006). ديگر فاکتورهاي حدت در استافيلوکوکوس اپيدرميديس شامل آنزيمها و توکسينهاي خارج سلولي از جمله متالوپروتئاز همراه با فعاليت الستاز، سيستئين پروتئاز، سرين پروتئاز، ليپاز، آنزيمهاي تغيير دهنده اسيدهاي چرب (FAME27) و توکسين دي28ميباشد. همچنين استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز منفي توليد لانتي بيوتيک ميکنند (ون ايف و همکاران، 2002). لانتي بيوتيکها باکتريوسينهايي از قبيل اپيدرمين هستند که عليه ديگر باکتريهاي گرم مثبت فعاليت ميکنند (رود و همکاران، 2004).
14-2- پاسخ به درمان:
ورم پستان ايجاد شده توسط استافيلوکوکوس اورئوس معمولا پاسخ ضعيفي به درمانهاي آنتي بيوتيکي ميدهد. شانس درمان با توجه به فاکتورهاي بسياري از جمله تعداد دورههاي شيرواري، شمارش سلولهاي سوماتيک قبل از درمان و توليد بتالاکتاماز توسط جدايههاي ايجادکننده ورم پستان از 85-15% متفاوت است (بارکما و همکاران، 2006). گزارشات منتشر شده کمي در ارتباط با درمان کوارترهاي عفوني توسط استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز منفي موجود ميباشد. بر اساس اين گزارشات به نظر ميرسد، ورم پستان ناشي از استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز منفي به خوبي به درمانهاي ضد ميکروبي جواب ميدهد. شانس درمانهاي باکتريايي براي استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز منفي که بتالاکتاماز توليد نميکنند، 90-80% ميباشد (تاپونن و همکاران، 2006). بتالاکتامازها، آنزيمهايي هستند که توسط بعضي باکتريها توليد شده و باعث تخريب حلقه بتالاکتام موجود در آنتي‌بيوتيکهاي گروه بتالاکتام شامل پني‌سيلينها و سفالوسپورينها مي‌شوند. براساس عملکرد، بتالاکتامازها به چهار گروه تقسيم ميشوند. برخي از اين آنزيمها ناشي از نوعي جهش بوده و آنزيم در عضوي به نام پلاسميد باکتري ساخته مي‌شود. جهت جلوگيري از گسترش اين گونه‌ها بايد از مصرف بي رويه آنتي بيوتيکها خودداري نمود و در مواجه با اين گونهها براي درمان از آنتي بيوتيکهاي مقاوم به بتالاکتاماز استفاده ‌شود. احتمال درمان براي استافيلوکوکوسهاي کوآگولاز منفي که بتالاکتاماز توليد نميکنند، پايينتر است (تاپونن و همکاران، 2006). اين پديده براي استافيلوکوکوس اورئوس نيز ثبت شده است (تاپونن و همکاران، 2003).
15-2- آزمونهاي تشخيص آزمايشگاهي:
1-15-2- نمونهها:
سواب سطحي، چرک، خون، آسپيراسيون ناي و مايع مغزي نخاعي (بسته به محل استقرار عفونت) به عنوان نمونه انتخاب ميشود (بروکس و همکاران، 2010).
2-15-2- تهيه گسترش:
استافيلوکوکوسهاي شاخص در گسترشهاي رنگآميزي شدهي چرک و يا خلط ديده ميشود. در گسترشها، متمايز کردن ارگانيسمهاي ساپروفيت از بيماريزا امکان پذير نيست (بروکس و همکاران، 2010).
3-15-2- کشت:
نمونههايي که در آگار خون دار تلقيح ميشوند، در مدت 18 ساعت در دماي C° 37 به کلونيهاي شاخص تبديل خواهند شد، اما ايجاد هموليز و توليد رنگدانه چند روز بعد اتفاق ميافتد. توليد رنگدانه و ايجاد هموليز در بهترين شکل خود در دماي اتاق ديده ميشود. استافيلوکوکوس اورئوس برخلاف ديگر استافيلوکوکوسها مانيتول را تخمير ميکند. نمونههايي که با فلور مخلوط ميکروبي، آلوده شده باشند را ميتوانيم در محيطهاي حاوي 5/7% نمک کشت بدهيم. نمک رشد اغلب ميکروارگانيسمهاي فلور طبيعي را مهار ميکند اما تاثيري بر روي رشد استافيلوکوکوس اورئوس ندارد (بروکس و همکاران، 2010).
4-15-2- تست کاتالاز:
اين تست براي بررسي حضور آنزيم پراکسيداز استفاده ميشود. به منظور انجام اين آزمون، يک قطره از محلول پراکسيد هيدروژن را روي يک اسلايد قرار داده و مقدار اندکي از رشد باکتريايي را روي محلول فوق اضافه ميکنيم. تشکيل حبابهاي گاز نشان دهنده مثبت بودن تست کاتالاز است (بروکس و همکاران، 2010).
5-15-2- تست کوآگولاز:
پلاسماي خرگوش (يا انسان) که حاويEDTA است و به نسبت يک به پنج رقيق شده باشد و با حجم برابري از کشت مايع رقيق شود و يا کلونيهاي سطح آگار که در دماي C° 37 رشد کرده باشد، براي انجام تست کوآگولاز مورد استفاده قرار ميگيرند. لولهاي از پلاسما که با محيط مايع استريل مخلوط شده باشد، به عنوان کنترل در نظر گرفته ميشود. اگر در مدت 4-1 ساعت، لخته تشکيل شود، تست کوآگولاز، مثبت خواهد شد (بروکس و همکاران، 2010).
6-15-2- تعيين حساسيت آنتي بيوتيکي:
نمونههاي استافيلوکوکوس که از عفونتهاي باليني جداسازي شده باشند، بايد به روشهاي رقيق سازي در آبگوشت و يا انتشار از ديسک مورد بررسي قرار بگيرند. مقاومت در برابر پني سيلين G بر اساس مثبت بودن تست بتالاکتاماز قابل پيشبيني خواهد بود؛ تقريبا 90% از سويههاي استافيلوکوکوس اورئوس، آنزيم بتالاکتاماز را توليد ميکنند. مقاومت در برابر نافسيلين (اگزاسيلين و متي سيلين)، در حدود 35% از نمونههاي استافيلوکوکوس اورئوس و تقريبا در 75% از نمونههاي استافيلوکوکوس اپيدرميديس، ديده ميشود. مقاومت در برابر نافسيلين با حضور ژن mecA ارتباط دارد. اين ژن يک پروتئين متصل شونده به پني سيلين (PBP2a29) را کد ميکند که نافسيلين روي اين ژن تاثيري ندارد. ژن mecA در روش واکنش زنجيرهای پليمراز قابل شناسايي است. اغلب آزمايشگاههاي باليني از يک روش فنوتيپي از قبيل کشت در محيط آگار غربال کننده اگزاسيلين، استفاده ميکنند. استافيلوکوکوسهايي که در آگار مولر- هينتون حاوي 4% نمک و g/mlμ6 اگزاسيلين رشد کرده باشند، به طور شاخص از نظر mecA مثبت بوده و مقاوم به نافسيلين هستند. به گونهاي جايگزين، روشي براي سنجش محصول ژن mecA، پروتئين PBP2a در شکل تجارتي در دسترس است که نسبت به روش واکنش زنجيرهای پليمراز براي ژن mecA و يا نسبت به آزمون بررسي مقاومت به روش کشت باکتري در محيط آگار نمک دار حاوي اگزاسيلين، بسيار سريع تر است (بروکس و همکاران، 2010).
7-15-2- تستهاي سرمي و تعيين تيپ:
تستهاي سرمي که براي تشخيص عفونتهاي حاصل از استافيلوکوکوس اورئوس، باشند ارزش کاربردي محدود دارند. روش تعيين تيپ مولکولي در ثابت کردن انتشار کلونهاي اپيدميک توليدکننده بيماري-هاي حاصل از استافيلوکوکوس اورئوس مورد استفاده قرار گرفته اند. الکتروفورز ژل پالس- فيلد30 و تعيين تيپ سکانس مولتي لوکوس31، قدرت تمايزدهندگي بالايي دارند (بروکس وهمکاران، 2010).
مواد و روشها
1-3- مواد و وسايل مورد نياز:
الف) مواد مصرفي براي کشت استافيلوکوکوس
1. محيط آگار حاوي خون گوسفند
2. محيط آگار حاوي خون خرگوش
3. محيط آگار حاوي خون اسب
4. محيط مانيتول سالت آگار
5. محيط نوترينت آگار
6. محيط مولر – هينتون براث
7. محیط TSB32
8. پلاسماي خرگوش
ب) وسايل مصرفي براي استخراج DNA
1. سمپلر 1000 ميکروليتري
2. سمپلر 100 ميکروليتري
3. سر سمپلر آبي، زرد و سفيد
4. لوله اپندورف
ج) محلول هاي مصرفي براي استخراج DNA
1. محلول TE33 (10mM Tris-HCl , pH=8.1 mM EDTA)
2. محلول SDS34 10 درصد(Roche, Germany)
3. پروتئيناز K (Fermentas, Germany, 20 mg/ml)
4. محلول NaCl 5 مولار (Merck)
5. محلول (CTAB3510 % ,NaCl 0.6 M) CTAB/NaCl
6. محلول فنل/ کلروفرم/ ايزو آميل الکل (25-24-1)، که اين مواد به صورت يک حجم ايزو آميل الکل، 24 حجم کلروفرم و 25 حجم فنل ترکيب شدند.
7. لیزوزیم (μg/ml 30)
8. ايزوپروپانول خالص (Merck)
9. اتانول 70 درصد سرد
د) مواد مصرفي براي انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز
1. dNTPs(Mμ50، سيناژن)
2. (75mM Tris-HCl, pH 9.0, 2mM MgCl2, 50mM KCl, 20mM [NH4]2SO4) PCRbuffer
3. Taq DNA Polymeras(سيناژن)
4. MgCl2 (سيناژن)
5. پرايمر R (سيناژن)
6. پرايمر F (سيناژن)
7. آب مقطر غير يونيزه (مخصوص واکنش زنجیرهای پلیمراز )
ﻫ) مواد مصرفي براي الکتروفورز
1. ژل آگارز (Agarose, Merck, Germany)
2. اتيديوم برومايد10mg/ml
3. مارکر (Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder SMO331 & Fermentas, Germany)
4. بافر بارگذار36 (6X Loading solution GBX8 & Fermentas, Germany)
5. Merck, Germany) 10X TAE37 Buffer)
6. 1X TAE
و) دستگاههاي مورد استفاده
1. دستگاه واکنش زنجیرهای پلیمراز (Bio – RAD)
2. دستگاه UV ترانس ايلوميناتور(BTS-20, Japan)
3. دستگاه الکتروفورز (Paya pajoohesh pars, Iran)
4. دستگاه سانتريفيوژ (Labnet, Edison NJ USA)
5. دستگاه بن ماري (Grant, Cambridge CB25Q2, England)
6. دستگاه Vortex (Mxcell, Iran)
ي) روش تهيه مواد و محلول هاي مصرفي:
محلول TE: براي تهيهTE، 1 سي سي Tris-HCl10mM(که با حل شدن g212/1Tris در يک ليتر آب بهدست ميآيد) با 1/0 سي سي 1mM EDTA (که با حل شدن g372/0EDTA در يک ليتر آب بهدست ميآيد) و 99 سي سي آب مقطر مخلوط گرديد و PH محلول به 8 رسانده شد.
1. محلول SDS10 درصد : 10 گرم SDS در 100 ميلي ليتر آب مقطر حل شده و تاC °68 در بن ماري گرم ميگردد تا حل شود.
2. 50X TAE Buffer: براي تهيه 242 گرم Tris-HCl، 1/57 میلی لیتر اسيد استيک و 10 میلی لیتر 0.5M EDTA در 600 سي سي آب مقطر حل شده و در نهایت به حجم یک لیتر و pH محلول به 5/8 رسانده شد.
3. TAE 1X: براي تهيه 20 سي سي از 50X TAE Buffer با 980 سي سي آب مقطر مخلوط شد.
4. تهيه پلاسماي خرگوش: يک عدد خرگوش خريداري شد و سپس به مقداري که حيات حيوان به خطر نيافتد از آن خونگيري به عمل آمد و خون به دست آمده به لولههاي حاوي EDTA منتقل شد. لولههاي حاوي خون خرگوش با دور rpm 3000 به مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ شدند. سپس محلول رويي که همان پلاسماي خرگوش بود، جمع آوري و در دماي °C20- نگه داري شد تا براي انجام تست کوآگولاز مورد استفاده قرار گيرد.
2-3- روش کار
1-2-3- جمع آوري نمونهها
20 جدايه استافيلوکوکوسی با منشا گاوي از شير و پوست گاوهاي شيري مبتلا به ورم پستان باليني و تحت باليني در شيراز جمع آوري شدند.
20 نمونه چرکي انساني از بيماران مراجعه کننده به بيمارستان نمازي واقع در شيراز به دست آمد.
9 سويه مرجع از سازمان پژوهشهاي علمي و صنعتي ايران تهيه شد (IROST38).
2-2-3- جداسازي استافيلوکوکوس با استفاده از روش كشت
ابتدا نمونههاي مختلف تهيه شده از منابع مختلف مستقيماً روي محيط آگار حاوي 5% خون گوسفند و يا نوترينت آگار کشت داده شد و در شرايط هوازي در دماي °C 37 به مدت 48- 24 ساعت گرمخانه گذاري شد و سپس روي کلونيهاي رشد يافته که از نظر شکل ظاهري صاف، کروي، بزرگ و چسبناک بودند، آزمايشهاي تشخيصي استافيلوكوكوسها بهشرح زير انجام و مورد بررسي و ارزيابي قرار گرفت.
الف) رنگ آميزي گرم:
با مشاهده كوكسي گرم مثبت خوشه انگوري با استفاده از رنگ آميزي گرم، ‌نمونهها مشکوک به استافيلوكوكوس شناخته ميشدند.
ب) تست كاتالاز:
اين تست روي اسلايد انجام گرفت. يك قطره آب اکسیژنه را روي لام گذاشته و يك كلوني از باكتري كه روي نوترينت آگار رشد يافته با آن مخلوط ميشد، كه بامشاهده حبابهاي هوا نتيجه مثبت در نظر گرفته ميشد.
ج) تست اكسيداز:
تكهاي از كاغذ صافي روي لام قرار داده و يك قطره از معرف اكسيداز روي كاغذ صافي ريخته ميشد. سپس يك كلوني از باكتري رشد يافته روي نوترينت آگار روي آن قرار داده ميشد كه با مشاهده رنگ بنفش بهعنوان مثبت تلقي شد.
د) رشد روي مانيتول سالت آگار:
باكتريهاي استافيلوكوکوس روي محيط مانيتول سالت آگار كشت داده ميشد، زيرا تمام استافيلوكوكوسها قادر بهرشد روي اين محيط ميباشند، اما با تغيير رنگ محيط كشت ازصورتي به زرد، باكتري رشد يافته به عنوان استافيلوکوکوس اورئوس در نظر گرفته ميشد.
ه) تست کوآگولاز:
اين تست در لوله آزمايش انجام ميگرفت بهاين صورت که تعداد 5-4 کلوني از هر نمونه باکتري مورد مطالعه با 5/0 ميلي ليتر پلاسماي حاوي EDTA خرگوش در لوله آزمايش استريل مخلوط ميشد و لولهها در دماي °C 37 به مدت 8-4 ساعت قرار داده ميشد و در فواصل زماني هر يك ساعت مورد بررسي قرار ميگرفت. بعد از گرمخانه گذاري اگر لخته در لوله تشکيل شده بود نتيجه مثبت در نظر گرفته ميشد.
و) تست هموليز:
بعد از تاييد جنس و گونه باکتريهاي مورد مطالعه بر اساس تستهاي بيوشيميايي، نوع هموليزين بر اساس ناحيه هموليز ايجاد شده توسط هر يك از جدايههاي مختلف روي محيط آگار حاوي خون گوسفند، اسب و خرگوش مشخص ميگرديد. به اين صورت که براي هر يك جدايههاي استافيلوكوكوس دو ميكروليتر ازسوسپانسيون باكتريايي در محيط مولر – هينتون (CFU/ml108) روي آگار حاوي خون قرار داده ميشد و پس از 20 تا 24 ساعت گرمخانه گذاري در دماي C° 37 و سپس 20 تا 24 ساعت قرار گرفتن در دمايC ‍‍‍° 4 هموليز هر يك از جدايههاي استافيلوكوكوس ارزيابي ميگرديد (تصوير 1-3). مرحله آخر براي مشخص كردن هموليز گرم – سرد بود كه توسط هموليزين بتا انجام مي گيرد (ساکولاس و همکاران، 2002).
با توجه به اينكه هموليزينهاي بتا و دلتاي استافيلوکوکوس اورئوس براي ليز كردن خون گوسفند حالت سينرجيست دارند، هموليزين دلتا در نمونه هاي مورد مطالعه براساس تشديد هموليز در ناحيهاي كه هموليزينهاي بتا و دلتا با هم برخورد ميكنند نيز مورد ارزيابي قرار ميگرفت. به اين صورت كه از سويه مولد هموليزين بتا به صورت يك خط در وسط پليت كشت داده ميشد و ساير نمونههاي مورد مطالعه به منظور بررسي هموليز دلتا به صورت خطوط عمود بر آن كشت داده ميشدند (شبيه تست CAMP). همچنين اين روش قادر به تفكيك بين سه نوع هموليزين استافيلوكوكوس نيز ميباشد،‌ به اين صورت كه هموليزين بتا قدرت ليز توسط هموليزين دلتا را افزايش ميدهد، ولي ليز كردن توسط هموليزين آلفا را مهار ميكند (ترابر و نويک، 2006 و ترابر و همکاران، 2008).
تصوير 1-3- هموليز کامل در استافيلوکوکوس
ه) تستهاي مولکولي
هموليزينهاي استافيلوکوکوس توسط ژنهایhld, hlb, hla و hlg که بهترتيب توکسينهاي دلتا، بتا، آلفا و گاما را توليد ميکنند، کد دهي ميشود. براي بررسي ژنوتيپي جدايههاي استافيلوكوكوس از نظر وجود يا عدم وجود ژنهاي مولد هموليزين، بعد از استخراجDNA ، واکنش زنجیرهای پلیمراز صورت گرفت.
1-مراحل انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز
الف ) استخراج DNA: براي استخراج DNAنمونه‌ها ابتدا ازروش غني سازي در محيط غني كننده TSB استفاده ميشد. در اين تحقيق براي جداسازيDNA باكتري از روش فنل/كلروفرم/ايزوآميل الكل استفاده گرديد.
روش استخراج DNA بدين صورت بود:
1- ابتدا نمونه‌ها از انكوباتور خارج و براي همگن سازي حدود چند ثانيه ورتکس ميشدند و سپس از مايع رويي نمونه‌هاي غني شده به ميزان 1سي سي در ميكروتيوب‌هاي 5/1 ميلي ليتري ريخته ميشد و به مدت 2 دقيقه با سرعتrpm 10000 سانتريفيوژ ميشدند.
2- به رسوب حاصل در ميكروتيوب‌ها 570 ميكروليتر از محلول TE (8=pH و
mM tris-HCl10 ـ mM Na2EDTA1) اضافه ميگرديد و سپس تا حل شدن كامل رسوب عمل مخلوط شدن انجام ميشد.
3- سي ميكروليتر محلول SDS 10 درصد به نمونه‌ها اضافه شد.
4- چهار ميكروليتر از پروتئينازK (Fermentas , Germany, 20 mg/ml) اضافه ميشد.
5- شش ميکروليتر ليزوزيم (mg/ml30) با هدف هضم ديواره سلولي اضافه ميشد.
6- نمونه‌ها مخلوط شده و سپس حدود يك ساعت در بن ماري در دمايC° 37 قرار داده ميشدند.
7- بعد از خارج كردن ميكروتيوب‌ها از بن ماري، 100 ميكروليتر NaCl پنج مولار اضافه شده و سپس عمل مخلوط کردن انجام ميگرديد.
8- صد ميكروليتر از محلول CTAB/NaCl(M6/0 NaCl، 10%CTAB) اضافه ميشد، و عمل مخلوط کردن بعد از اضافه كردن محلول CTAB/NaCl تكرار ميشد.
9- ميكروتيوب‌ها حدود 12 دقيقه در بن ماري در دمايC °65 قرار داده ميشدند.
10- حدود 550 ميكروليتر از محلول كلروفرم/ ايزوآميل الكل به نمونه‌ها اضافه شده و نمونه‌ها بعد از عمل ورتکس حدود 7 دقيقه با دور 13000 سانتريفيوژ ميشدند.
11- بعد از سانتريفيوژ از مايع رويي ميكروتيوب‌ها حدود 550 ميكروليتر خارج شده و به ميكروتيوب‌هاي جديد منتقل ميشدند.
12- هم حجم مايع برداشت شده (حدود 550 ميكروليتر) از محلول فنل/ كلروفرم/ ايزوآميل الكل به ميكروتيوب جديد اضافه ميشد.
13- نمونه‌ها ورتکس شده تا رنگ محلول شيري شود، سپس حدود 7 دقيقه در 1300 دور سانتريفيوژ ميشدند.
14- بعد از سانتريفيوژ از مايع رويي نمونه‌ها (حدود 500 ميكروليتر) برداشت شده و به ميكروتيوب جديد منتقل ميگرديد.
15- به هر ميكروتيوب حدود 6/0 حجم مايع برداشت شده (حدود 300 ميكروليتر) ايزوپروپانول اضافه شده و ميكروتيوب‌ها تا ظاهر شدن رشته‌هاي سفيد رنگ DNA به آرامي تكان داده ميشدند.
16- سپس نمونه‌ها حدود 5 دقيقه با دور 10000 سانتريفيوژ ميشدند.
17- مايع رويي ميکروتيوب ها دور ريخته مي شد و سپس به ميکروتيوب ها حدود 100 ميکروليتر اتانول 70 درصد سرد اضافه شده و به آرامي مخلوط ميشد تا DNA آب دهي شود.
18- نمونه ها حدود 3 دقيقه با دور 10000 سانتريفيوژ ميشدند تا DNA رسوب داده شود.
19- با دقت محلول رويي ميكروتيوب‌ها دور ريخته شده و بعد از خشك كردن ميكروتيوب‌ها به آنها 50 ميكروليتر محلول TE اضافه شده و بعد از مخلوط کردن آرام در دمايC °20- تا هنگام انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز نگهداري ميشدند (اصلاح شده احمدي و همکاران، 2010).
پرايمرها : براي تشخيص ژنهاي هموليزين هاياستافيلوکوکوس که شاملhld, hlb,



قیمت: تومان

دسته بندی : مقاله و پایان نامه

دیدگاهتان را بنویسید