دانلود پایان نامه ارشد : بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش Swim-up در زمان های مختلف

دانلود پایان نامه رشته زیست شناسی

گرایش : سلولی و مولکولی

عنوان : بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش   Swim-up در زمان های مختلف

دانشگاه مازندران

دانشکده علوم پایه

 

پایان نامه ی دوره ی کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی سلولی و مولکولی

 

موضوع:

بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش   Swim-up در زمان های مختلف

 

اساتید راهنما:

دکتر فاطمه رودباری

دکتر محمد علی خلیلی

 

بهمن ماه 1391

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

چکیده

یکی از علت های شکست و عدم موفقیت در تکنیک های کمک باروری(ART) قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی است، که ممکن است با انکوباسیون طولانی مدت اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد به وجود آید. لذا در این مطالعه میزان قطعه قطعه شدن و آپوپتوز DNA اسپرم انسانی بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up در زمان های مختلف انکوباسیون به وسیله تست SCD و تکنیک TUNEL مورد ارزیابی قرار گرفت.

در این مطالعه آینده نگر، بیست ویک نمونه ی اسپرم نرمال مورد مطالعه قرار گرفت. برای بررسی مورفولوژی اسپرم از رنگ آمیزی  Papanicolaou و قابلیت حیات اسپرم از رنگ آمیزی Eosin-Nigrosin  استفاده شد. نمونه ها در دمای 37 درجه سانتی گراد بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up در زمان های مختلف انکوبه شدند. قطعه قطعه شدن DNA در فواصل زمانی مختلف (3،2،1،0 ساعت) با استفاده از تست SCD مورد بررسی قرار گرفت. اسپرم های دارای هاله بزرگ و متوسط، DNA سالم داشتند و اسپرم هایی که دارای هاله کوچک و بدون هاله بودند DNA قطعه قطعه شده داشتند. میزان آپوپتوز نیز به وسیله تکنیک TUNEL مورد ارزیابی قرار گرفت.

میانگین مورفولوژی نرمال و حرکت پیشرونده اسپرم بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up  53/2±33/72 و 02/1±10/90 بوده است. میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم به میزان معنی داری افزایش یافت بعد از دو ساعت (935/0±81/8، 004/0 P=) و بعد از سه ساعت (894/0±76/10، 0001/0 P=) انکوباسیون نسبت به زمان صفر (809/0±38/4) بوده است. همچنین میزان آپوپتوز DNA اسپرم در زمان دو ساعت انکوباسیون نسبت به زمان صفر  (864/0±19/9، 008/0 P=) و نیز زمان سه ساعت نسبت به زمان یک ساعت ( 7/0±97/10، 002/0 P=) انکوباسیون معنی دار شده است.

در نهایت نتیجه ای که ما به آن دست یافته ایم نشان می دهد که انکوباسیون اسپرم نرمال در دمای 37 درجه سانتی گراد که به روش Direct swim-up آماده شده برای استفاده در تکنینک های کمک باروری (ART) باید زمانی کمتر از دو ساعت باشد.

واژه های کلیدی:

اسپرم نرمال، قطعه قطعه شدن DNA، انکوباسیون، تست SCD، تکنیک TUNEL.

 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                          صفحه

فصل اول- مقدمه1

1-1- روش های كمك باروری2

1-2- ناباروری.5

1-3- تولید اسپرم .5

1-4- مایع انزالی.6

1-4-1- آنالیز مایع انزالی.7

1-5- پارامترهای اسپرم.10

1-5-1- مورفولوژی.10

1-5-2- تحرک اسپرم12

1-5-3- درجه بندی تحرک اسپرم 14

1-5-4- قابلیت حیات اسپرم14

1-5-5- حجم.15

1-5-6- غلظت.16

1-6- انواع مرگ سلولی و تعریف آن.18

1-6-1- نکروز18

1-6-2- آپوپتوز سلولی18

1-6-2-1 مراحل آپوپتوز 19

1-6-2-2 مسیر های آپوپتوز21

1-6-2-3- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز.21

1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز .23

1-6-2-4-1-  بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول .23

1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول24

1-6-2-4-2-  بررسی سیتوتوکسیسیتی 24

1-6-2-4-3-  بررسی تغییرات مورفولوژی 25

1-6-2-4-3-1-  استفاده از میکروسکوپ الکترونی25

1-6-2-4-3-2-  استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس25

1-7-  منشاء آسیب DNA اسپرم26

1-7-1-  بسته بندی غیرطبیعی كروماتین.27

1-8-  ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری 28

1-8-1-  بررسی ساختار کروماتین اسپرم.28

1-9-  نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم.29

1-10-  استرس اكسیداتیو به واسطه ROS30

1-11-  تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA  و میزان موفقیت روشهای کمک باروری.31

1-11-1-  مصرف سیگار.31

1-11-2-  مواجهات شغلی.32

1-11-3-  داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی33

1-11-4-  سن.33

1-12-  تكنیك­های بررسی ساختار كروماتین33

1-12-1-  روش­های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان.34

1-12-1-1- تست TUNEL.35

1-12-1-2- روش DBD-FISH.35

1-12-1-3- روش Comet.36

1-12-1-4- رنگ­آمیزی CMA336

1-12-1-5- تكنیك SCSA37

1-12-1-6- تست  SCD37

1-12-1-7- رنگ­آمیزی آكریدین اورانژ39

1-12-1-8- رنگ­­آمیزی تولوئیدین بلو39

1-13- روش مهاجرت اسپرم39

1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت.40

فصل دوم- مواد و روش ها.41

2-1- مواد و وسایل  مورد نیاز.42

2-1-1- وسایل مورد نیاز.42

2-1-2- مواد مورد نیاز.42

2-2- ساخت محلول های مورد نیاز45

2-2-1- ساخت محلول Ham’s F10.45

2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)46

2-2-3- ساخت محلول تانل46

2-2-4- ساخت محلول (PBS).46

2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین.47

2-2-6- ساخت رنگ رایت.47

2-3- روشها48

2-3-1- روش جمع آوری اسپرم. 48

2-3-2- آنالیز مایع انزالی 48

2-3-2-1- آزمایشات ماکروسکوپی48

2-3-2-1-1-  ظاهر48

2-3-2-1-2- آبکی کردن48

2-3-2-1-3-  حجم48

2-3-2-1-4-  چسبندگی48

2-3-2-2- آزمایشات میکروسکوپی.49

2-3-2-2-1- آگلوتیناسیون50

2-3-2-2-2- بررسی تعداد اسپرم50

2-3-2-2-2-1- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش .50

2-3-2-2-3- ارزیابی تحرک51

2-3-2-2-3-1- روش کار52

2-3-2-2-4- ارزیابی قابلیت حیات53

2-3-2-2-4-1- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین.53

2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی54

2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا54

2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن.54

2-3-2-2-5-3-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا.55

2-3-3-  Direct swim-up.57

2-3-3-1- روش کار57

2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD).58

2-3-4-1- روش کار.58

2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل.60

2-3-6- آنالیز آماری62

فصل سوم- نتایج.63

3-1 نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی تحرک اسپرم64

3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قابلیت حیات اسپرم67

3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی مورفولوژی اسپرم68

3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم.70

3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم72

3-6- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی آپوپتوز اسپرم75

3-7- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم78

3-8- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم.79

3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم80

3-10- نتایج کلی80

فصل چهارم- بحث81

4-1- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم.83

4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم.84

4-3- پیشنهادات.90

منابع

چکیده انگلیسی

 

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                          صحنه

1-1- ساختار اسپرم انسانی9

1-2- ارزیابی آسیب DNA توسط: .A.TUNEL, B.COMET, C.CMA337

1-3- تست  SCD38

2-1- انواع مختلف آگلوتیناسیون50

2-2- MAKLER CHAMBERبرای شمارش اسپرم استفاده می شود51

2 -3- شکل لامل MAKLER CHAMBER .52

2-4- چگونگی قرارگیری لوله فالکون بازاویه 45 درجه در انکوباتور.57

3-1- رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین برای سنجش میزان زنده یا مرده بودن اسپرم67

3-2- رنگ آمیزی پاپانیکولا 69

3-3- تست SCD برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم میباشد74

3-4- رنگ آمیزی TUNEL76

 

 

 

 

 

 

فهرست جدول ها

عنوان                                                                                                   صفحه

1-1 : خصوصیات میکرسکوپی نمونه انزال طبیعی مطابق با استاندارد های سازمان بهداشت جهانی (2010/WHO).17

2-1- ساخت Ham’sf1045

2-2- محلول های لازم برای رنگ آمیزی پاپانیکولا55

3-1-مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از آماده سازی اسپرم 71

3-2-مقایسه میانگین اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA آپوپتوز اسپرم77

3-3-مقایسه مقدار P اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم.77

3-4- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم78

3-5- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم79

 

 

 

 

 

 

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                  صفحه

3-1- مقایسه میانگین حرکت پیشرونده، حرکت سریع و حرکت کند قبل و بعد از آماده سازی اسپرم به روش Swim-up.66

3-2- مقایسه میانگین قابلیت حیات و مورفولوژی اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش  Swim-up68

3-3- مقایسه میانگین حرکت پیشرونده و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش   Swim-up70

3-4- مقایسه میانگین قطعه قطعه شدن DNA  اسپرم در زمان های مختلف انکوباسیون بعد از آماده سازی به روش  Swim-up.73

3-5- مقایسه میانگین آپوپتوز  اسپرم در زمان های مختلف انکوباسیون بعد از آماده سازی به روش  Swim-up.76

تعداد صفحه : 124

قیمت : 14700تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ****       serderehi@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  **** ***